非辅酶依赖型喹啉加氧酶HOD催化机制的理论计算和实验研究

O2-involving enzymatic reactions play critical roles in aerobic metabolism, most of which depend on cofactors to activate triplet dioxygen. Recently it has been found that a significant number of oxidases and oxygenases can activate dioxygen in the absence of cofactors; but their reaction mechanisms remain unrevealed. On the basis of our previous theoretical study on the cofactor-independent dioxygenase BluB in the biosynthesis of vitamin B12, we will carry out theoretical and experimental studies on molecular mechanisms for cofactor-independent quinoline dioxygenase HOD in the biodegradation of quinoline contaminants: 1) establish the whole reaction pathway of HOD-catalyzed quinoline oxidation with the active site model strategy; 2) study the structural relationship between substrate and the enzyme by virtual substrate-probe method; 3) demonstrate the roles of peroxide intermediates such as dioxetane and dioxolane during the reaction; 4) conduct chemical kinetics experiments to investigate the rate-limiting step and key intermediates, so as to verify the above calculated mechanisms. The results will improve the understandings of this type of aerobic metabolism in quinoline oxidation, provide mechanistic reference for cofactor-independent oxygenases, and promote the biodegradation of quinoline contaminants in environmental science.

氧气参与的酶促反应在很多生命代谢过程中扮演着重要的角色，大部分以氧气为底物的酶都依赖于辅酶来活化氧气。近年来科学家发现少数加氧酶或氧化酶却不依赖于任何辅酶就能够活化氧气，然而对其催化机制尚缺乏足够的认识。基于申请人对维生素B12生物合成途径中的非辅酶依赖型加氧酶BluB的机理研究成果，本项目拟对喹啉污染物生物降解途径中的非辅酶依赖型加氧酶HOD的分子机理展开如下的理论计算和实验研究：1）运用活性中心模型的计算策略，建立完整的HOD催化反应路线；2）利用虚拟底物探针分子，深入研究底物的化学结构对活化氧气的影响；3）阐明二氧杂环丁烷和二氧杂环戊烷两种过氧化物中间体在催化加氧反应中的角色；4）通过化学动力学实验，揭示反应决速步和关键中间体，验证所提出的反应机理。本申请的研究结果将完善对生物利用氧气机制的理解，为非辅酶依赖型酶的机理研究打下基础，并为发展喹啉污染物的生物降解提供新的思路。

氧气的代谢在众多生物的生命过程中起到关键的作用。生物体内氧气的反应需要在温和的条件下被精确调控，既要克服氧气额外的活化势垒，还要保证代谢过程中的活性氧物种不会造成其它损害。在本课题中，我们选取喹啉加氧酶HOD作为研究对象，其不依赖辅酶即可催化氧气代谢的特性使其能够很好的帮助我们理解生命体催化氧气反应的机制。1）首先，基于前期对BluB等酶的研究基础，我们构建了HOD的活性中心模型，通过量化计算的方法建立了完整的HOD催化反应路线，并在此基础上针对关键的氧气活化进行了深入的研究，揭示了氧气的结合方位以及酶蛋白的氨基酸网络对于精确调控氧气活化的重要作用，并证明了超氧负离子自由基是HOD活化氧气的关键中间体，很好的解释了已有的实验结果。2）我们还通过分析氧气活化过程中的电子结构变化，初步构建了评估小分子活化氧气难易程度的方法，分析了多种可能作为HOD底物的类似物分子，并与已有的实验结果形成良好对照，为拓展HOD的功能、降解更多可能的环境中喹啉类污染物打下了基础。3）此外，我们在此项目中完成了HOD酶蛋白的质粒构建及突变、蛋白表达纯化，构建并完善了相关生物实验流程，并完成了对三种HOD突变体以及四种喹啉类似物的动力学实验测定。综上，在本项目的资助下，我们阐明了HOD催化的非辅酶依赖特性的化学本质，测试了HOD在降解环境喹啉污染物方面的应用潜力，此项目积累的实验及理论计算的技术，还为后续研究其它重要的氧气代谢酶提供了基础。