一种黄素依赖型单加氧酶催化机理研究

黄素依赖型单加氧酶参与广泛的生命活动，包括生物荧光发生、抗生素合成和DNA合成等，可进行区域选择性和立体选择性的氧化反应，在生物好氧降解和生物催化中有重要意义。Mycobacterium goodie X7B的单加氧酶是上述酶类中双组份酶的一员，其单加氧酶组份DszC在二苯并噻吩代谢中起关键作用，还可氧化吲哚生成价值高且有药用价值的靛蓝和靛玉红。前期研究表明，DszC具有同时利用FMNH2和FADH2两种黄素的特性，这在单加氧酶系中是较少见的，且目前对该类单氧化酶组份研究较少。本申请拟采用快速停流装置跟踪反应进程的方法，测定酶促反应的一系列动力学和热力学常数表征该酶，并推测其反应机制。同时还将以2-和3-氘代吲哚为底物进行研究，以期获得DszC对吲哚区域选择性氧化规律、同位素效应和产物与酶的相互作用等数据。这将使我们深入了解单加氧酶的作用机理，并为它们在生物催化领域的开发利用提供理论依据。

本项目拟对古地分枝杆菌（Mycobacterium goodii）X7B的dszC基因进行克隆和功能验证，并对其编码的单加氧酶DszC进行详细的机理研究。.由于在菌株X7B测序的基础上找到一个更具研究价值的脱硫操纵子和一个在“4S”代谢途径末端产物2-羟基联苯（2-HBP）具解毒作用的O-甲基转移酶（HBPOMT），本研究在项目方向上进行了调整：对新发现脱硫操纵子相关基因的克隆及功能验证；对编码甲基转移酶HBPOMT基因的寻找、克隆、功能验证和该酶生理生化性质的研究。.脱硫基因操纵子NODE_1104（GenBank：JF740062.1）上的dszC基因（dszC-X7B）和标准菌株IGTS8的dszC的相似性为71.2%，还有一个比此基因大48 bp的基因dszC-L，将这两个基因连接入pET28a后纯化得两种长度的酶，进行活性验证与最适反应条件，辅酶FMN是测定DszC-X7B酶活性的必须辅酶，相较于30-37C的酶最适温度，该酶在45C条件下反应仍有一定活力。较适辅酶条件为4 mM NADH和20-50 μM FMN。较长酶DszC-L活性与DszC-X7B活性类似。.根据现有菌株X7B的测序结果对X7B中所有注释为O-甲基转移酶的序列和其它脱硫菌株进行比对发现对“4S”途径末端产物2-HBP进行甲基化的O-甲基转移酶序列。将该序列连接入表达载体pET28a中进行表达纯化和性质研究，结果表明该基因的表达对2-HBP的毒性有降低作用，此作用可通过降解二苯并噻吩（DBT）生成2-HBP的大肠杆菌工程菌较同时表达hbpomt基因的工程菌的生长情况差推断得知。对纯化的HBPOMT性质研究表明该酶以S-腺苷-L甲硫氨酸为甲基供体，镁离子为辅因子，最适反应pH为8-9，最适反应温度为30-37C，在45C下仍有活性，在37C下孵育7小时活性仍保留60%。.实验中分离得到的一株脱硫菌，通过16S rDNA比对的方法确定为芽孢杆菌属，其在48C仍能正常生长，能耐受的最大DBT浓度为40 mM；除DBT以外，这株菌还能以DBTO2作为单一硫源进行正常生长，利用气相色谱测定它在以DBT为单一硫源的条件下生长的代谢产物，发现了“4S”途径的末端产物2-HBP和延伸“4S”途径产物2-甲氧基联苯（2-MBP）。..相关成果正在进行整理，相信不久即可发表。