金纳米颗粒不对称功能化及其在免疫诊断中的应用研究

Immunodiagnosis, one of the important parts in in vitro diagnosis, has received considerable attention owing to its well-known advantages such as high-throughput detection and no requirement of sophisticated instruments. However, both the detection sensitivity and specificity of the commonly-used clinical immunoassays are unable to fulfill the requirements for early diagnosis and monitoring of fatal diseases such as cancer and HIV. We herein would like to develop an enhanced homogenous immunoassay. This assay depends on the asymmetrically functionalized gold nanoparticles that were separately modified with detection antibodies and enzymes (used for signal generation) on the two sides of nanoparticles. Multiple layers of enzymes will be prepared on one side of the nanoparticles by means of copper-free click chemistry, thus avoiding the steric hindrance of the immunoreaction of detection antibodies anchored on the other side. Detection targets could be sensitively and quantitatively measured in a colorimetric way through the enzyme-catalyzed growth of gold nanoparticles. Finally, the efficacy and feasibility of the immunoassay in clinical use will be evaluated by utilizing a great number of clinical samples, the results of which will be compared with the standard methods that are being used in the clinic.

免疫诊断是临床体外诊断的重要组成部分，因其高通量、不依赖复杂精密仪器等优点而备受青睐。然而，目前临床上常用免疫诊断方法的检测灵敏度和特异性往往不够高，难以实现对肿瘤及HIV等重大疾病的早期诊断和病情适时监测。本项目拟发展一种均相免疫诊断系统。该诊断系统基于不对称功能化金纳米颗粒，即在金纳米颗粒的两侧分别修饰检测抗体和催化产生检测信号的酶。利用非铜催化点击反应，选择性地在金纳米颗粒一侧修饰多层酶，大大提高了载酶量，同时不影响另一侧检测抗体的免疫识别功能。通过酶催化的金纳米颗粒生长反应，实现对靶标物质的高灵敏度、可视化定量检测。最后，通过对大量临床样品进行分析，并与临床标准诊断方法进行对比，评估本诊断系统的准确性及其在临床应用方面的可行性。

免疫检测技术在生化检测、疾病诊断、药物筛选、食品安全等领域被广泛使用。目前，免疫检测方法主要依赖小分子化合物作为读出信号，灵敏度较低，且无法进行多靶标高通量分析。在本项中，我们发展了系列基于金纳米颗粒功能化修饰方法（尤其是不对称功能化金纳米颗粒修饰方法），并与目前的免疫检测和其他形式的检测平台结合，开发了针对不同检测靶标的分析成像方法，根据读出形式的不同，主要分为以下三类：. （1）在可视化检测方面，我们发展了基于抗体功能化金纳米颗粒原位生长的免疫检测方法。与传统的ELISA相比，该方法免去了多次洗涤与孵化的步骤，只需要两步操作，具有快速、使用方便、成本低廉等特点，适合现场检测。此外，我们利用贵金属纳米颗粒较高的消光系数这一特性，针对临床检测中存在的靶标含量低、特异性差等问题，构建了一系列高灵敏、高特异性、读出简单的可视化检测新方法，并应用于疾病标志物的检测。. （2）在荧光检测方面，我们将金纳米粒子的局域表面等离子增强效应与杂交链式反应结合，利用金纳米粒子的原位荧光增强效应，极大地提高了杂交链式反应产物的荧光信号，发展了超高灵敏度的定量检测新方法。. （3）在拉曼检测方面，我们发展了一种不对称修饰金纳米颗粒的方法，并以此金纳米颗粒作为拉曼增强基底，发展了一系列高灵敏、多通道的表面增强拉曼光谱（SERS）检测与成像新方法。与此同时，我们全面革新了目前所用的拉曼报告分子，创新性地提出并发展了基于外源性报告基团（如炔基、氰基等）的SERS生物检测成像新方法，使得检测信号处于细胞拉曼沉默区（cellular Raman-silent region, 1800-2800 cm-1），且为半峰宽仅为几纳米的单峰。在此区域，生物体完全不产生背景荧光和拉曼信号的干扰，从而实现无背景、无串色的SERS检测，为高信背比、多通道生物医学检测与成像奠定了坚实基础。