马立克氏病疫苗经II型补体受体激发保护性免疫应答的分子机制研究

Marek's disease vaccine is regarded as the first tumor vaccine in the world, which has been widely applied to prevent the lymphoproliferative disease in chickens. However, the mechanism of the MD vaccination is poorly understood, especially in which B cell regulates T cell response and intervenes oncogenesis. In present study, the proliferation and activation of chicken B cell will be investigated firstly by measuring the expression level of CR2 on B cell surface and monitoring signaling molecules and effector molecules downstream of the B cell receptor (BCR) after chickens are immunizated with MD vaccine,in view of the critical role of complement receptor 2 (CR2) in B cell response. Subsequently, the release level of cytokines and ratio between CD4+ and CD8+ T lymphocyte subsets will be examined in order to explore the influence of CR2 on delivering MDV antigen signals from B to T cells. Furthermore, to test and verify CR2 functions as a mediator between host immune responses stimulated by MD vaccination, the recombinant Marek's disease viruses that can express chicken complement 3d (the ligand of CR2) will be generated by manipulating the MDV genome into bacterial artificial chromosomes (BAC). Then the correlation between virus replication and protection effects will be analyzed post vaccination with above recombinant viruses. The purpose of this study is to elucidate the molecular mechanism of CR2 participating in process of immune protection induced by MD vaccination. The anticipated results will provide evidence for developing novel MD vaccine in the future.

马立克氏病（MD）疫苗是世界上第一个肿瘤的疫苗，被广泛用来预防鸡的淋巴细胞增生性疾病。但人们对MD疫苗免疫的机理知之甚少，尤其是B细胞在调节T细胞免疫反应和干扰肿瘤形成的作用尚不清楚。鉴于II型补体受体（CR2）在B细胞免疫应答时起关键作用，本项目拟通过测定鸡体B细胞表面的CR2表达水平及B细胞受体（BCR）下游信号与效应分子的变化情况，来研究MD疫苗接种后B细胞增殖及活化；通过检测细胞因子的释放水平以及CD4+、CD8+T细胞亚群比例变化情况，来探索CR2对B细胞传递MDV抗原信号至T细胞的影响；为进一步验证CR2介导MD疫苗刺激宿主免疫反应的作用，我们还将利用细菌人工染色体技术（BAC）构建携带CR2的配体补体因子C3d的重组马立克氏病毒，然后分析重组疫苗免疫后，淋巴细胞中病毒复制水平与保护效果的相关性。本项目旨在阐明CR2参与MD疫苗诱导免疫保护的分子机制，为研发新型MD疫苗提供依据

马立克氏病（MD）疫苗是被广泛用来预防鸡的淋巴细胞增生性疾病。但人们对MD疫苗免疫的机理尚不清楚。II型补体受体（CR2）是B细胞的重要组成部分， 在B细胞对抗原免疫应答时起关键作用，CR2的配体为补体的裂解终产物C3d，因此探讨CR2及C3d相互作用介导下，MD疫苗免疫后的B细胞的免疫应答和信号传递机制对阐明该疫苗的免疫机理具有重要的科学意义。受资助经费和时间的限制，本研究以马立克氏病病毒血清 III型毒株的火鸡疱疹病毒（HVT）为模型，初步研究了其在C3d介导下诱导免疫反应的机制。我们首先克隆了鸡B细胞表面受体成份即II型补体受体CR2 的配体补体因子C3d的全基因序列， 然后对鸡C3d基因进行了遗传进化分析和杆状病毒表达并制备了下一步实验所需的抗体。在此基础上，利用细菌人工染色体（BAC）技术以及反向遗传操作技术，构建了携带C3d基因的重组马立克病毒rHVT-C3d. Western－blot和间接免疫荧光（IFA）结合共聚焦显微镜观察证实重组病毒中携带的C3d基因在鸡胚成纤维细胞中获得高效表达。利用PCR 和Western-blot检测不同代次病毒中C3d基因定位和蛋白表达，证实了该重组病毒的遗传稳定性。动物试验结果表明，重组病毒免疫1日龄SPF鸡后，21天内采集免疫鸡的血清中和效价与亲本病毒之间没有明显差异，但外周血淋巴细胞在LPS刺激下发现有显著性增殖，而在conA 的刺激下则未见显著变化，表明C3d介导HVT 诱导了B 细胞增殖，而不是T淋巴细胞增殖。此外，我们还发现重组病毒HVT-C3d在外周血淋巴细胞中的复制水平明显高于亲本HVT免疫组，而且流式细胞术对T淋巴细胞CD3+、CD4+ 和 CD8+ 的分析结果表明：rHVT-C3d组能够刺激T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+相对比例明显下降，即具有内源性杀伤作用的细胞毒性T细胞的效应将增强，将有利于清除侵入体内的野毒MDV。马立克超强毒株RB1B攻毒试验进一步显示，该重组病毒HVT-C3d比亲本HVT能够提供更好的免疫保护力。这些结果初步阐明，II型补体受体（CR2）参与了血清 III型马立克疫苗HVT的免疫应答过程。本研究为今后新型MD疫苗的研发提供依据和物质基础。本研究产生了2篇中文核心期刊论文，一篇SCI论文和一项国家发明专利。 培养博士研究生1名，硕士研究生2名。