血管内皮生长因子受体KDR/flk-1启动区域所形成G-四联体的NMR溶液结构研究

The therapy targeting angiogenesis in tumor has become the research focuses recently. Vascular endothelial growth factor(VEGF) and its receptor (VEGFR) play key roles in vascular growth. KDR/flk-1 is one of the most important receptors of VEGF, because it regulates the pivotal signal transduction, making it be a good cancer therapeutic target. It was revealed that guanine rich sequence was found in the KDR/flk-1 promoter region, which can form a G-quadruplex conformer. The G-qaudruplex formation in this region would block the KDR / Flk-1 transcription, thus reduces its expression quantity. To better understand the mechanism of KDR/flk-1 promoter G-quadruplex formation and gene regulation, in this project, we will investigate the human KDR/flk-1 promoter G-quadruplex and its three dimensional structure by using NMR techniques，so that we can present the structural basis for rationally designing or screening small molecule ligands of G-quadruplex,and further finding drug leads for KDR/FLK-1 related diseases.

当前抗肿瘤研究的热点之一是抗肿瘤血管生成的治疗方法。在血管生长发育过程中，血管内皮生长因子（VEGF）与其受体VEGFR起关键性作用。KDR/flk-1是VEGFR中最重要的一种，所介导的信号通路是其中关键的调节途径，因此是一个理想的抗癌药物靶标分子。研究表明，KDR/flk-1基因的启动区域包含GC富集区，易形成G-四联体结构。若在KDR/flk-1基因启动区域的DNA中形成稳定的G-四联体结构，势必会阻断KDR/flk-1转录，从而降低该蛋白的表达。为了更好了解KDR/flk-1启动区域G-四联体的形成与基因调控的机制，本项目以NMR为主要手段研究人KDR/flk-1基因的启动区域G-四联体的形成及其三维结构，以期为合理设计或筛选该G-四联体的配体分子，进而找到治疗与其有关疾病的药物分子提供结构基础。

当前抗肿瘤研究的热点之一是抗肿瘤血管生成的治疗方法。在血管生长发育过程中，血管内皮生长因子（VEGF）与其受体VEGFR起关键性作用。KDR/flk-1是VEGFR中最重要的一种，所介导的信号通路是其中关键的调节途径，因此是一个理想的抗癌药物靶标分子。研究表明，KDR/flk-1基因的启动区域包含GC富集区且易形成G-四联体结构。若在KDR/flk-1基因启动区域的DNA中形成稳定的G-四联体结构，势必会阻断KDR/flk-1转录，从而降低该蛋白的表达。为了更好了解KDR/flk-1启动区域G-四联体的形成与基因调控的机制，本项目首先利用NMR技术对VEGF的碱基序列进行筛选，以得到单一的、亚氨基质子信号基本没有重叠的、及亚氨基质子信号数目与碱基G的数目基本相等为标准，最终得到单一构象G4-DNA的VEGF碱基序列。然后对序列中每个G进行15N 标记，采集1H-15N HSQC图谱中的第一道FID信号，对碱基G的亚氨基质子进行有效准确归属，并在此基础上采集1H-13C远程相关的HSQC图谱，归属碱基序列中每个G的H8质子，结合残基内的NOE、自旋相关利用1H-1H COSY、 TOCSY及1H-31P HETCOR完成对每个碱基进行自旋体系的识别，碱基序列进行特异性识别，最后结合残基间NOE确定形成G4-DNA中哪4个G形成一个tetra 平面，确定了三个碱基平面（G16，G11,G20与G23）（G15，G10，G22与G1）(G13,G9,G21与G2)，有效地明确了VEGF G4的拓扑结构；再基于残基内NOE确定每个碱基芳环与糖环之间的顺反构型，明确G1、G19与G20是顺式构象，其他碱基为反式构象。最后，将NOE转化为距离约束，利用Xplor-NIH 软件，顺利完成了人KDR/flk-1基因的启动区域G-四联体的三维结构，从而为治疗与其有关疾病的药物分子提供结构基础。通过本项目的实施，培养博士生1名，硕士生2名，发表标注基金项目的SCI学术论文5篇，另外1篇文章在修改中。