去泛素化酶USP22在乳腺癌干细胞增殖和干性维持中的作用及调控机制

USP22, a member of the ubiquitin-specific modified enzyme family, is significantly associated with highly malignant cells. The research indicated that USP22 is a putative cancer stem cell marker, and cancer stem cells are believed to be the root cause of tumor recurrence, metastasis and treatment resistance. So far，the relationship of USP22 with breast cancer stem cells are still poorly understood. Our previous experiments suggest that USP22 is overexpressed in high grade breast tissues. USP22 knockdown also impaires stem cell properties in cancer cell and destabilizes SIRT1.Taken together with previous studys, we postulated USP22 may regulate the proliferation and stemness of breast cancer stem cells through deubiquitinating SIRT1 gene. To validate our hypothesis, we planed to use serials of cellular and molecular assays such as tissue microarray immunohistochemistry, flow cytometry,and immunoprecipitation etc in clinical samples, culture cells and intensive deficient mice to analysis the correlation of USP22 expression with cancer stem cells from breast cancer patients and its clinical significance. Furthermore, we will examine the effects of USP22 on proliferation and stemness of breast cancer stem cells and try to dissect the underlying epigenetic mechanisms. The project will continue Previous studies on the correlation USP22 and breast cancer, and help to reveal the biological function of USP22 and understand the knowledge of breast cancer stem cells. The successful accomplishments of this project will be of great significance for the understanding of breast cancer recurrence and metastasis, and drug resistance. It may also provide new insight and target for potential breast cancer therapy.

USP22属于泛素特异性水解酶家族，在部分高度恶性肿瘤细胞中表达，是肿瘤干细胞样标志基因之一，而肿瘤干细胞被认为是肿瘤复发、转移和治疗耐药的根源。迄今对USP22与乳腺癌干细胞的关系仍知之甚少。我们预实验提示USP22在乳腺癌中高表达，沉默USP22能够减弱乳腺癌干细胞特性，降低SIRT1的活性表达。根据前期结果和文献资料，我们提出USP22可能通过去泛素化修饰SIRT1调控乳腺癌干细胞增殖和干性的假说。为验证这一假说，我们综合运用组织芯片免疫染色、流式细胞术、慢病毒载体转染和免疫共沉淀等技术从临床组织标本、细胞及重症缺陷鼠等层面探讨USP22和乳腺癌干细胞的相关性及临床意义，明确USP22去泛素化调控乳腺癌干细胞增殖和干性的作用及其机制。本研究将从去泛素化酶USP22这个新视点认识乳腺癌干细胞干性调控，为揭示乳腺癌发生、转移和耐药的新机制奠定基础，为进一步研究乳腺癌的治疗方案提供新思路。

USP22属于泛素特异性水解酶家族，是肿瘤干细胞样标志基因之一，在介导细胞生长与分化和细胞周期进展等方面具有重要调控作用。本课题从临床标本、细胞及体内动物等不同层面，综合运用了组织芯片免疫染色、载体转染技术、实时定量PCR、蛋白免疫印迹、细胞悬浮培养、流式细胞检测及细胞分选、免疫共沉淀和动物移植瘤等技术，对USP22参与调控乳腺癌细胞生长增殖和干性的分子机制进行了初步研究。首先，临床方面通过制备组织芯片运用免疫组织化学技术，检测了USP22、CD44/CD24和干细胞标志物SOX9的表达情况，明确了CD44+/CD24-/low在乳腺癌临床预后中的意义及其能作为乳腺癌干性水平的临床指标；并发现USP22与CD44+/CD24-/low组合之间存在明显相关性，二者可同时作为乳腺癌的预后指标；其次，在细胞水平筛选出了高、低表达USP22的乳腺癌细胞系,构建了USP22过表达和沉默质粒，通过细胞转染技术，发现沉默USP22表达后，乳腺癌细胞增殖能力降低、细胞周期中的G1期细胞比例和细胞凋亡数量明显增多；通过流式细胞检测和乳腺癌细胞球克隆形成研究发现当沉默USP22的表达时乳腺癌细胞球形成能力减弱、CD44+/CD24-群百分比降低，说明其干性能力降低；反之，当过表达USP22时，细胞球形成能力增强、CD44+/CD24-群百分比增多，干性增加；最后我们通过生物学信息及免疫共沉淀技术明确USP22与SIRT1具有互作关系；进一步利用转染技术将高表达USP22和Sirt1的细胞中的Sirt1蛋白进行沉默，结果表明沉默Sirt1后USP22的生物学功能受到明显抑制，转染后的CD44+/CD24-群细胞的百分比也并未发生明显改变，因而我们推测USP22通过Sirt1的去泛素化调控乳腺癌细胞的生物学行为改变及乳腺癌细胞干性能力的获得。综上所述，本研究为探讨去泛素化酶USP22在调控乳腺癌干细胞干性方面的机制研究奠定了坚实的工作基础，为认识乳腺癌转移、耐药方面提供了重要的启示性线索。项目资助发表SCI论文1篇，待发表文章两篇；培养研究生4名，其中1名已经取得博士学位，1名在读，2名已经取得硕士学位。项目投入经费23万元，支出19.6586万元，各项支出基本与预算相符。剩余经费3.3414万元计划用于本项目研究后续支出。