胃癌17q21.33缺失区内候选基因TOB1功能及其失活机制的研究

Results of our previous NSFC grant indicate TOB1 may be a tumor suppressor gene in gastric cancer (GC). According to these preliminary data, the biological function and anti-tumor mechanism of TOB1 will be investigated in GC cell lines, clinical tissues, and GC mouse models in this project. First, amplification, transcription, and expression of TOB1 was detected in GC cell lines and GC tissues. Especially, evaluation of phosphorylation of TOB1 associated with clinicopathological features will be made to validated the significance of the gene in GC. Then， roles of TOB1 in cell proliferation, cell cycle distribution, apoptosis, invasion and metastasis will be examined by establishing stably expressed or knock-downed cells in vivo and in vitro. Finally, transcriptome of TOB1 transfected cells will be detected by next generation sequencing to obtain the signal pathway involved in TOB1 function, and clarify the association between TOB1 and ErbB-2 in GC. In addition, function of cellular localization and validation of the specific phosphatase will provide new diagnosis markers and therapeutic targets in GC.

我们前一国自然课题初步表明TOB1基因是胃癌相关抑癌基因。在此基础上，本项目拟通过胃癌细胞系、组织及裸鼠荷瘤模型，开展胃癌中TOB1基因功能及其失活机制研究。首先从DNA、mRNA和蛋白质水平检测胃癌细胞和组织TOB1及其磷酸化形式，分析TOB1及其磷酸化与临床病理相关性，明确TOB1磷酸化累积在胃癌中的重要性；进一步通过构建TOB1基因真核表达载体/siRNA干扰载体观察调控TOB1表达对其在体外（胃癌细胞）和体内（裸鼠荷瘤模型）生物学功能（包括胃癌细胞增殖、周期分布、凋亡及恶性生物学表型）的影响；最后经转录组测序和生物信息学分析揭示TOB1相关肿瘤信号通路，探讨胃癌中TOB1与ErbB-2功能关系；通过阻断TOB1核输出/输入确定TOB1胞核/胞浆亚细胞定位与抗增殖活性关系；确认TOB1去磷酸化的磷酸酶证明TOB1磷酸化与其抗增殖能力关系；以期为胃癌临床诊治提供新靶标。

课题组先期通过微卫星标记杂合性缺失（LOH）确定临床原发性胃癌样本中候选抑癌基因TOB1（17q21.33 LOH区），并对该基因进行表达分析，首次揭示TOB1基因表达下调和磷酸化积累与胃癌密切相关。在此基础上，本项目进一步从分子、细胞、动物模型和临床患者胃癌组织样本四个层面开展胃癌中TOB1基因功能及其失活机制的研究。.从临床患者胃癌组织水平，分别采用FQ-PCR、WB、IHC和IF技术从DNA、mRNA和Pr水平分析544例临床胃癌组织芯片样本和6株胃癌细胞系中TOB1基因的表达、磷酸化修饰及其亚细胞分布，结果表明胃癌细胞核中TOB1蛋白减少及p-TOB1蛋白增加与胃癌进程显著相关（P<0.05）；细胞核TOB1蛋白磷酸化累积的肠型胃癌患者预后较差（P<0.05）；实验结果证明TOB1蛋白磷酸化累积在临床胃癌（尤其肠型胃癌）中的重要性。.从细胞和动物模型水平，分别建立稳定沉默/过表达TOB1基因的胃癌细胞系HGC-27/AGS进行体外细胞功能学分析调控TOB1基因表达对胃癌细胞生物学表型影响，结果证明沉默/过表达TOB1能显著增强/减弱胃癌细胞HGC-27/AGS的生长增殖和迁移侵袭等恶性表型，证明了TOB1基因的抑癌作用；成功建立人胃癌细胞异种移植瘤鼠的动物模型。.从分子水平，分别阻断TOB1蛋白核输入（NLS）/输出（NES）信号分析TOB1在胞浆/胞核的亚细胞定位与抗增殖活性关系， 结果证明TOB1蛋白在细胞核中发挥抗增殖作用； 转录组测序分析揭示胃癌中TOB1相关的信号通路网络；质谱分析确定胃癌细胞MKN-1中TOB1蛋白2个新磷酸化位点（Thr172/Ser320），经Ser/Thr激酶抑制剂抑制TOB1蛋白磷酸化能显著减弱胃癌细胞恶性表型。.通过本项目研究明确了胃癌相关抑癌基因TOB1功能及其失活机制，提供了胃癌新靶标，为胃癌临床诊断和靶向治疗奠定了理论和实验基础。