活化DAP12信号通路诱导肝移植免疫耐受的分子机制研究

Liver immune system plays a crucial role in the regulation of liver internal and external immune response and the maintenance of self-homeostasis. As a peripheral immune organ, liver can induce immunologic tolerance. In clinical practice, it is easier to get tolerance for liver allograft, so we are going to investigate the allograft tolerance induction using mouse liver transplant model. The liver allograft tolerance can be reversed in DAP12 knock out mouse liver transplantation. It has already provided a reliable experimental base to find the molecular mechanism of DAP12 signing pathway to liver transplant tolerance. Firstly, we are going to make the allogeneic mouse liver transplant model and the evaluation system for liver transplantation outcomes, and obtain experimental materials from mouse models to reach the specific aims of our proposal by the methods of flow cytomtry, gene chips and immunoprecipitation with DAP12 signaling pathway fluorescent reporter (NATF-GFP) cell model. (1) To compare the differences of immune cells phenotypes, immune molecules and DAP12 signaling pathway related molecules between DAP12-/- and wild type mouse in liver transplantation; (2) To screen the coding genes of upstream receptors and their ligands in DAP12 signaling pathway; (3) To express several candidate receptor genes on NFAT-GFP cell line to verify our hypothesis and finding. If the upstream receptors and ligands of DAP12 signaling pathway are identified in liver allograft tolerance, it will provide new insights to design drugs and treatment schemes in organ transplant rejection and autoimmune diseases.

肝脏器官维持自身环境稳定方面发挥重要作用。肝脏作为外周免疫器官具有产生免疫耐受的能力, 临床上人体肝移植较其它器官移植容易获得免疫耐受。DAP12-/-小鼠肝移植失去免疫耐受为探索诱导器官移植免疫耐受形成的分子机制提供了实验动物模型。以我们前期建立了以DAP12关联的免疫受体信号通路GFP报告细胞膜型为基础，建立同种异体小鼠肝移植模型和肝移植效果评价体系，从动物模型中提实验材料，应用流式细胞技术，基因表达芯片和DAP12免疫沉淀和蛋白质谱分析: 1)对比小鼠DAP12-/-和WT肝移植物中免疫细胞表型，免疫分子和DAP12信号通路相关分子基因表达的差异；2)筛选出DAP12信号通路上游受体分子及其配体分子的编码基因；3)将候选受体表达基因分别表达于DAP12-NATF-GFP细胞，筛选和发现其配体分子。确定DAP12信号通路上游分子为设计诱导器官移植免疫耐受和治疗自身免疫病的药物提供新思路

临床肝移植较易获得免疫耐受。本课题以DAP12基因敲除小鼠肝移植模型出现免疫耐受逆转作为立项依据。前期构建以DAP12分子通路报告细胞系统作为基础，开展DAP12分子在肝移植免疫耐受中发挥的作用及其分子机制研究。(1)获取了DAP12-/-及其对照鼠肝移植术后30天的移植肝组织和受体的器官组织中的基因表达谱系差异数据，推测DAP12分子通路活化在减缓肝移植排斥中的基因线索；(2)应用DAP12高表达Raji细胞与移植肝组织悬液共孵育，通过免疫沉淀的方法和蛋白质谱分析发现了与DAP12偶联的受体TREM-2受体表达增高，并获得TREM-2受体是引起DAP12分子通路活化的关键受体；(3) 随即构建以TREM-2为细胞表面受体的TREM2-DAP12-Syk-GFP 报告细胞模型作为工具，筛选与TREM-2受体结合的配体分子与DAP12下游的分子活化机制。.本项目研究取得成果如下: A)通过成功构建NKG2D-DAP12分子通路报告细胞模型与应用，获2019年国家发明专利(ZL 2016 1 0274268.3)，该项发明，为研究与DAP12分子关联的上游其他受体分子活化通路提供关键技术；B)通过基因表达谱差异性分析获得了相对于DAP12基因敲除后，WT动物肝移植中DAP12分子通路活化DAP12上游关联的受体和DAP12下游分子通路引起免疫抑制的信号分子重要的线索；C)通过构建高表达的DAP12细胞株和免疫沉淀，蛋白质谱技术应用，找到了DAP12分子通路上游关键的关联受体为TREM-2；TREM-2受体的表达上调或肝移植内环境的TREM-2配体分子的增多，是引起肝移植免疫耐受的关键分子机制，为研究建立移植免疫耐受和自身免疫病的治疗提供了重要的应用前景；D)构建TREM-2受体报告细胞模型，搜索与TREM-2受体结合并引起TREM2-DAP12分子通路活化的配体分子，目前尚未获得具体何种或几种配体分子的实验数据。在本项目的研究中，我们获得了DAP12分子通路的上游TREM-2受体的关键数据，分析与TREM2受体结合的配体分子的实验数据尚在继续推进之中。我们初步获得了TREM2-DAP12分子通路活化下游的效应: 如引起的M2型巨噬细胞增多，一些抑制性免疫受体表达上调和IL-10分泌增加等，为我们进一步描绘TREM2-DAP12分子通路在免疫耐受的分子机制提供了重要的数据