大鼠脑干呼吸相关核团5-HT、NE能神经纤维参与OSAS、LTF调控的机制研究

Hypoglossal long-term facilitation (LTF) is thought to be in close relationship with treatment for obstructive sleep apnea syndrome (OSAS). Serotonergic (5-HT) and norepinephrinergic (NE) nerve fibers have been demonstrated to be attributed to LTF expression. However,their intracellular signaling mechanisms underlying LTF formation are largely unknown so far. Our pilot studys first identified different synaptic characteristics between 5-HT and NE innervation that 5-HT made excitatory synapses and NE formed excitatory-inhibitory dual synaptic transmissions onto neurons in the hypoglossal nucleus in rats. We hypothesized a pathway of 5-HT/NE (presynaptic) → 5-HT2AR/α1-AdR (cell membrane) → CaMKII/PKC (postsynaptic) → CREB (nucleus) that would contribute to LTF expression. Using immunohistochemical, immunoelectron microscopic, electrophysiological, and molecular biological approaches, we aimed to investigate mechanisms of synaptic plasticity in mediation of LTF expression in brainstem respiratory network, including the pre-B?tzinger complex,the hypoglossal nucleus, and the ambiguus nucleus,in OSAS and LTF rat models. We wish to unravel different functional roles of 5-HT and NE nerve system in attribution to LTF expression. The present study will provide experimental evidence and treatmental strategies for OSAS sleep disorder diseases.

舌下神经长时程易化(LTF)与阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)的治疗密切相关。5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NE)能神经纤维参与LTF表达，但其细胞内信号机制不清楚。我们预实验首先发现舌下神经核内5-HT主导兴奋性突触传递，而NE表现兴奋-抑制双重突触传递特征，我们提出了LTF表达的5-HT/NE(突触前)→ 5-HT2AR/α1-AdR(胞膜)→ CaMKII/PKC(突触后)→ CREB(胞核)机制。本项目拟以慢性间断性缺氧（CIH）、LTF大鼠模型为实验平台，以脑干呼吸网络(包括pre-B?tzinger complex、舌下神经核、疑核)为研究对象，以上述通路为研究核心，结合免疫组化、免疫电镜、电生理、分子生物学等技术，探讨舌下神经LTF表达的突触可塑性机制，明确5-HT、NE能神经纤维在其中的不同功能意义，为OSAS等睡眠呼吸紊乱疾病提供实验依据和治疗对策。

呼吸中枢pre-Bötzinger complex（pre-BötC）不仅产生呼吸节律，还参与呼吸可塑性调控。研究呼吸可塑性最常用的动物模型是长时程易化（long-term facilitation, LTF）大鼠模型。急性间断性缺氧（acute intermittent hypoxia, AIH），可诱导膈神经或舌下神经产生超出正常水平、持续增强长达1小时以上的高大呼吸节律电信号，产生LTF。dAIH（daily AIH）表达较单纯AIH更为高大、持久的LTF。.生命中枢位于延髓，呼吸中枢pre-BötC与心血管紧张中枢C1神经元相互交织，密切接触，共同参与心血管-呼吸调控。我们应用dAIH诱导呼吸LTF，免疫电镜观察了pre-BötC神经元（NK1R标记）和心血管紧张中枢C1神经元（DβH标记）的突触联系。研究发现DβH免疫反应（immunoreactive, ir）金颗粒分布在胞体、轴突终末和树突，以轴突终末最为密集。DβH-ir轴突终末多形成非对称型突触，提示其兴奋性突触特征。NK1R-ir DAB产物主要分布在胞膜下，勾勒NK1R-ir神经元的胞体和树突。DβH-ir轴突终末与NK1R-ir树突形成非对称性突触，提示C1去肾上腺素能神经元对pre-BötC神经元的兴奋性调控作用。 dAIH干预增加了NK1R-ir突起的数量，上调了DβH表达，提示dAIH干预加强了心血管-呼吸中枢局部网络联系，增加了二者的协同作用。.细胞色素氧化酶（cytochrome oxidase, CO）是呼吸链的最后一个酶，参与电子转运，氧化磷酸化，产生ATP，CO活性变化与细胞能量代谢密切相关。在中枢神经系统中，神经元动作电位→线粒体ATP产生→CO活性紧密偶联，因此CO活性变化是反映神经元能量代谢和功能的重要指标。我们应用CO组化染色，免疫电镜观察了pre-BötC突触后树突线粒体形态变化、突触联系以及CO活性。实验发现在dAIH干预下，pre-BötC突触后树突线粒体表现了超微结构的可塑性，包括线粒体局部膨大、局部变细经狭窄的树突基底部延伸至树突棘内，体现了树突棘-线粒体通讯的形态学特征；线粒体的长度和面积增加，同时CO活性明显增加，且高CO活性线粒体更多的分布到突触后，提示pre-BötC突触后线粒体可改变形状，更多的接近突触，为其提供能量，调控局部Ca2+调控。