基于固有免疫细胞γδT17抑制的积雪草抗结肠炎效应成分阻遏CAC的机制研究

The malignant transformation of colitis is one of the main reasons for the occurance of colorectal cancer. Up to date, there is no reliable drug to prevent and treat colitis-associated colorectal cancer (CAC). Madecassic acid, a natural PPARγ agonist isolated from Centalla asiatica herb, was previously shown to significantly ameliorate colitis and CAC in mice. This project aims to unravel the anti-CAC mechanism of madecassic acid based on its anti-colitis profiles and the crucial role that γδT17 cells play in the development and progression of CAC. At first, we evaluate the inhibitory effect and characteristics of madecassic acid on CAC induced by AOM/DSS in mice, and its effect on the percentage and activation of γδT17 cells in the mucosal lamina propria. According to the time-course and the antagonistic effect of adeno-associated virus (AAV) encoding IL-17, γδT17 cells are proven to be the target cells of madecassic acid. Then, the effect of madecassic acid on the activation of Syk-PI3K/Akt-mTORC1 pathway is examined to elucidate the key signaling pathway responsible for the inhibition of γδT17 cell activation. Moreover, the effect of madecassic acid on γδT17 cells-mediated chemotaxis of MDSCs is studied. Finally, the PPARγ dependence for madecassic acid inhibiting the activation of γδT17 cells, the recruitment of MDSCs, and CAC should be confirmed by using specific antagonists of PPARγ in APCmin/+ CAC mice. The findings would contribute to the development of madecassic acid as a potential anti-CAC agent, and increase our understandings to the pathogenesis of CAC.

结肠炎恶性转化是结直肠癌发生的重要原因，目前尚无理想的防治药物。积雪草来源的羟基积雪草酸（MA）作为天然的PPARγ激动剂，可显著改善小鼠溃疡性结肠炎和结肠炎相关性结直肠癌（CAC）。本课题基于MA抗结肠炎的机制特点及γδT17细胞在CAC发生发展中的重要作用，探究MA阻遏CAC的关键机制。在AOM/DSS模型小鼠，考察MA对CAC的抑制作用和特点，及其对结肠黏膜固有层γδT17细胞数目/活化的影响，依据时程关系分析和高表达IL-17等，证实γδT17为其主要效应细胞；基于Syk-PI3K/Akt-mTORC1通路等，阐明MA抑制γδT17细胞活化的信号途径；此外，考察MA对γδT17细胞介导MDSCs趋化的抑制作用和机制；最后，在APCmin/+小鼠，验证MA抑制γδT17细胞活化、MDSCs趋化及改善CAC的PPARγ依赖性。预期成果有助于MA的开发利用，并加深对CAC病理机制的认识。

羟基积雪草酸（羟酸）是从积雪草中分离得到的一种五环三萜酸，灌胃给药可通过降低结肠组织IL-17水平改善DSS诱导的小鼠结肠炎，但其下调IL-17水平的靶细胞尚不清楚。此外，羟酸能够显著抑制小鼠结肠癌的发展，但在体外对结肠癌细胞并无直接杀伤作用，提示羟酸可能通过抑制慢性炎症及其恶性转化，阻遏结直肠癌的发生发展。本研究基于γδT17细胞活化在结肠炎及其恶性转化中的参与和重要作用，探索羟酸对结肠炎相关结直肠癌（CAC）的阻遏作用和机制。.羟酸灌胃给药有效改善CAC模型小鼠体重下降，降低死亡率，减少肿瘤数目、大小和负荷，降低促炎因子水平，改善组织病变，减少细胞恶性增殖，增强瘤内细胞凋亡。羟酸有效增加CD8+ T细胞和NK细胞数目，减少骨髓来源的抑制性细胞（MDSCs）数目，降低Gr-1、iNOS和COX-2表达水平。羟酸降低结肠组织中MDSCs相关趋化因子表达，且对IL-17A表达的抑制作用最为显著。CAC小鼠结肠组织中IL-17A主要来源于Th17和γδT17细胞，羟酸对γδT17细胞比例和数目的下调作用更为明显。而过继转移γδT17细胞显著减弱羟酸对CAC小鼠结肠组织中γδT17细胞和MDSCs数目及其功能因子表达的抑制作用，及其抗CAC效应。.采用信号通路广筛抗体芯片进行信号途径筛选，并通过western blot进行验证。结果显示，γδT17细胞活化以及羟酸抑制γδT17细胞活化可能与PPARγ-PTEN/Akt/GSK3β-mTOR途径相关。但深入研究发现，羟酸抑制γδT17细胞活化与mTOR之间不存在依赖关系，而可能通过减少NFATc1的核定位抑制γδT17细胞活化。在CAC模型小鼠，联用PPARγ拮抗剂显著减弱羟酸对γδT17细胞活化、MDSCs数目、肿瘤免疫细胞和小鼠CAC的抑制作用，提示羟酸以PPARγ依赖的方式阻遏小鼠CAC。.综上，羟酸通过抑制结肠组织γδT17细胞活化，减少IL-17表达，阻止MDSCs募集，从而增加CD8+ T细胞和NK细胞数目，阻遏CAC的发生发展，其抑制γδT17细胞活化的机制可归纳为：激活PPARγ→增加PTEN表达→抑制Akt磷酸化→抑制GSK3β活化→减少NFATc1核转位。本文从调节肠道固有免疫的角度，揭示了羟酸防治CAC的机制，为其开发利用提供了依据。