Cell-SELEX技术筛选乳腺癌干细胞方法的建立

我国乳腺癌的发病率逐年增高，治疗不敏感、易复发转移等均成为乳腺癌治疗的难点，乳腺癌干细胞正是肿瘤复发、转移的根源所在。因此，分离纯化肿瘤干细胞，从而针对性的对乳腺癌干细胞进行系统研究，成为彻底治愈乳腺癌的关键。本课题旨在运用细胞-指数富集的系统进化技术（cell-SELEX）建立一种新的筛选乳腺癌干细胞的方法。运用大容量的随机寡核苷酸文库，结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，找到能结合乳腺癌干细胞的高特异性、高亲和力的适配子（aptamer），进一步通过流式细胞术（FCM）利用适配子纯化分离出乳腺癌干细胞，然后在裸鼠动物模型上进行验证。本课题的实施将可以建立一种新的乳腺癌干细胞筛选技术，为今后乳腺癌干细胞的功能及生物学特性的研究奠定基础。

背景：我国乳腺癌的发病率逐年增高，治疗不敏感、易复发转移等均成为乳腺癌治疗的难点，乳腺癌干细胞正是肿瘤复发、转移的根源所在。因此，分离纯化肿瘤干细胞，从而针对性的对乳腺癌干细胞进行系统研究，成为彻底治愈乳腺癌的关键。.目的：旨在运用细胞-指数富集的系统进化技术（cell-SELEX）建立一种新的筛选乳腺癌干细胞的方法并筛选出乳腺癌干细胞特异性的适配子（aptamer）。.方法：将MCF-7细胞在无血清培养基中培养成的乳腺球细胞作为正向筛选的细胞，将正常乳腺上皮细胞MCF-10A和MCF-7sal细胞（经盐霉素作用的MCF-7细胞）作为负向筛选的细胞。利用大容量的随机寡核苷酸文库（ssDNA library），结合体外PCR扩增技术，以指数富集能结合乳腺球细胞的ssDNA，去除能结合MCF-10A和MCF-7sal细胞的ssDNA，经过多轮筛选，最终得到能结合乳腺球细胞的高特异性、高亲和力的适配子。.结果：经过13轮的筛选，我们分离得到具有高特异性，高亲和力的能结合乳腺球细胞MS03适配子。在体外进行比较MS03+细胞与CD44+/CD24-/low细胞的乳腺球形成率，发现两者之间无明显差异。并且63.3%的MS03+细胞中显示CD44+/CD24-/low表型。由于MS03适配子容易人工合成，无免疫原性，所以该适配子具有替代CD44/CD24成为乳腺癌干细胞的标志的能力。.结论：MS03适配子可作为乳腺癌表面标志在乳腺癌诊断及治疗中具有可广泛应用前景。本课题建立了一种新的乳腺癌干细胞筛选技术，为今后乳腺癌干细胞的功能及生物学特性的研究奠定基础。