微囊藻毒素抗体的广谱特异性结构基础与定向调控研究

Research on antibodies with broad specificity is a hot area in immunoassay due to its strong simultaneous screening capability to multi-analyte. Thus, it is of great significance to investigate the structure basis of the broad specificity of antibodies for better understanding and the artificial control of the immunoassay performance. Previously, we have obtained three broad specificity monoclonal antibodies with a recognition to both microcystins and nodularin. In this investigation, the fragment of antigen-binding (Fab) would be prepared by enzymatic digestion of monoclonal antibodies. The key site information of the broad specific fragment would be cleared with the X-ray diffraction analysis based on the crystal structure of Fab and its complex. The site-directed mutagenesis is carried out to the key residues and to evaluate the activity of mutants, and then the different recognition mechanism of the broad specificity can be explained. Finally, the antibody broad specificity combined with the antibody specificity, sensitivity, affinity will be regulable, based on computer assisted virtual screening, reverse PCR and so on. This research is of important scientific significance to the antibody modifying, hapten design, structure-activity relationship and immunoassay development.

具有广谱识别性能的抗体因可以实现多残留检测而成为当前食品污染物免疫分析的研究热点，深入研究抗体的广谱特异性结构基础，对于实现其分析性能的人工调控具有重要意义。本项目拟在前期已获得可同时识别微囊藻毒素和节球藻毒素的广谱特异性单克隆抗体基础上，酶解单抗获取抗原结合片段（Fab），制备Fab单晶及其与多种藻毒素的复合物晶体，利用X-射线衍射技术解析晶体结构，明确藻毒素抗体广谱特异性的关键位点信息，结合抗体特异性、灵敏度、亲和力等参数以及计算机辅助虚拟筛选、反向PCR等手段，进行关键残基的定点突变，评价分析突变体活性，阐释广谱性识别差异机制，实现藻毒素抗体特异性的定向调控。该研究对于指导半抗原类物质的抗体改造、构效关系、免疫分析方法等研究，具有重要科学意义。

微囊藻毒素(Microcystins, MCs)具有强烈的肝毒性以及致癌作用，可以通过饮用水及在动植物中的积累接触人类，严重危害人类健康和生态安全。MCs家族庞大，现有的免疫检测方法主要集中在一种或少数几种毒素同时检测，远不能适应检测需求。此外，由于目前抗体与MCs的识别机制研究较少，尚难解答半抗原结构对抗体性能的影响及指导人工调控抗体广谱性能。.本项目前期根据天然微囊藻毒素和节球藻毒素共有侧链基团设计合成5种半抗原，通过免疫动物与单克隆筛选，获得了存在不同广谱特异性特点的单克隆抗体（命名为LH和GAA）。基于此，制备了高纯度的 LH-Fab 和 GAA-Fab 片段，建立了高效率、高纯度的Fab酶解及纯化方法，并通过间接酶联免疫吸附法(ic-ELISA)考察了二者的广谱特异性。制备了LH-Fab和GAA-Fab片段单体及其与代表性MCs复合物晶体，解析了分辨率在2.8Å以下的LH-Fab-NOD-R、GAA-Fab、GAA-Fab-MC-LR/-NOD-R 4种晶体结构（蛋白结构已上传PDB数据库）。此外，构建了两株抗体的scFv大肠杆菌异源表达系统，基于晶体结构信息进行虚拟氨基酸突变实现了抗体亲和力成熟。基于晶体结构与突变前后的抗体广谱特异性活性特征，明确了藻毒素抗体广谱特异性的关键位点信息，阐释了微藻毒素广谱性识别差异机制，实现了对藻毒素抗体广谱特异性的人工调控。同时，开发了水样及水产品样品中的微囊藻毒素酶联免疫分析、电化学传感器和结合智能手机的多功能荧光免疫分析方法等多种新型分析方法。依托项目共发表了学术论文9篇，其中第一标注SCI论文3篇，申请专利3项。