基于微囊藻毒素纳米抗体荧光/磁性双模式探针的研究

Microcystins are major cyanobacterial hepatapeptide toxins found in freshwater and brachish environments, and have been proved to be one of the strong promoters of hepatocellular carcinoma. The detection of microcystins will be the most credible evidence of people exposing to the toxin and critical for the prevention of liver tumor. There is currently an urgent requirement for highly-sensitive, rapid and in-expensive detetion methodologies for these toxins in vivo. People get nanobodies based on molecular engineering and phage display technology, which is the smallest antibodies so far. Based on the microcystin-LR nanobody which our study group successfully obtain from the versatile nanobody repertoires recently, this project will optimize the nanobodies of microcystins, and combine the application of magnetic resonance imaging and optical in vivo imaging, to establish a new method for the detection of microcystins. At the same time, we will discuss the validity, the feasibility and the imaging mechanism of the Microcystin Nanobodies/Magnetite Nanoparticle/Cyanine5.5 dual-modality probe in vivo and in vitro in this research. The nanobodies of microcystins will be a new material for the future mechanism research of microcystins and provide a new way for the early prevention of hepatocellular carcinoma.

微囊藻毒素（Microcystin，MC）是肝癌的强促进剂。体内MC的检出，是机体接触MC后，最直观的检测指标，对于肝癌的早期预防意义重大。针对目前缺乏一种安全、经济、高灵敏度的示踪监测生物体内MC方法的现状，本项目组在前期筛选得到分子量小、稳定性强、生产方法简单且特异性高的MC纳米抗体（VHHMC-LR）的基础上，提出基于纳米抗体与抗原的特异性免疫反应，以VHHMC-LR为高效识别分子，二氧化硅壳核型四氧化三铁磁性纳米微粒为载体，花菁素5.5为荧光报告基团，综合利用磁共振和荧光成像的优点，构建VHHMC-LR荧光/磁性双模式探针，建立一种实时动态检测体内MC的新方法。检测探针表征，优化反应条件，以得到强顺磁性、稳定的探针；通过MTT法、溶血实验、肌肉植入实验等评价探针的生物安全性；优化检测条件，将其应用于体外及生物体内MC的检测，研究成像效果和机制，为MC促肝癌作用的机制研究提供新技术。

微囊藻毒素（Microcystin，MC）是淡水湖泊中由蓝细菌产生的一类天然毒素，是肝癌的强促进剂。微囊藻毒素的检测，是机体接触该毒素后，最直观的检测指标，对于肝癌的早期预防意义重大。针对目前缺乏安全、经济、高灵敏度的示踪监测微囊藻毒素方法的现状，本项目优化筛选得到分子量小、稳定性强、生产方法简单且特异性高的微囊藻毒素-LR纳米抗体（VHHMC-LR）。并研究利用VHHMC-LR制备MC-LR免疫亲和层析柱过程中的主要影响因素，包括抗体配体的纯化，载体的选择、偶联抗体的最佳浓度，配体与载体的偶联时间、载体残留活性基团的封闭时间等，纯化浓缩的抗体亲和常数介于2.235*107至5.698*107之间，满足免疫亲和层析抗体亲和常数需介于107至1012之间的要求。制备的免疫亲和柱对藻毒素具有特异性吸附作用。亲和柱间差异很小，变异系数为0.026。免疫亲和柱吸附效果与国家标准反相C18柱比较无显著性差异，吸附效果肯定。本研究建立了一种特异性高、吸附性能好、洗脱分离完全的免疫亲和层析预分离藻毒素的方法，为环境水体中藻毒素的筛选与检测探索提供新方法和新技术。同时，本研究以微囊藻毒素DNA适配体（Apt MC-LR）作为高效识别分子，利用聚乙二醇（PEG）包覆四氧化三铁磁性纳米微粒（Fe3O4@ PEG）作为载体，花菁素5.5（Cy5.5）作为荧光报告基团，成功制备Apt MC-LR荧光/磁性纳米探针（MNP-Apt MC-LR-Cy5.5）。对纳米探针MNP-Apt MC-LR-Cy5.5进行电镜成像，呈现出典型的单分散性的核壳结构，MNP-Apt MC-LR-Cy5.5的水动力尺寸为18.49±4.75nm，尺寸分布范围很窄，粒径分布均一，Zeta电位为-28.5±5.13mV，且制得溶液静置48h未见沉淀及分层现象，说明其在水相具有良好的稳定性。本研究应用MTT法检测所制备的MNP-Apt MC-LR-Cy5.5在体外对Vero细胞和HepG2细胞生长、增殖的影响。综上所诉，本研究的结果为探讨有效、实时动态监测MC-LR提供了行之有效的技术手段，有助于研究监测微囊藻毒素在肝脏肿瘤发生、发展中的作用机制。