MC1R基因对羊驼毛囊干细胞表达毛色蛋白的影响

羊驼的主要经济价值在于其独特的优质毛皮和丰富毛色，而这种丰富毛色的形成主要取决于其中黑色素（即真黑素和褪黑素）的分布和比例。阐明毛色基因控制羊驼毛色形成的机理，并通过分子生物学手段人工调控或改造羊驼毛色，使之适合于人类对动物天然毛色的需求具有重大理论和实践意义。本项目以我国"948"项目引进的南美羊驼（Alpaca）为研究对象，用流式细胞术等现代技术手段分离获取羊驼毛囊干细胞，为进一步研究羊驼毛囊干细胞特性及其在被毛和毛色形成中的作用提供理论依据和技术平台；将调控动物黑色素生成的主要基因- - MC1R基因转染入羊驼毛囊干细胞并使其表达，探索MC1R通过毛囊干细胞调控羊驼毛色蛋白表达的机制，揭示该基因与羊驼毛色形成的关系。从而为阐明羊驼毛色形成的分子机理、通过分子生物学技术人工调控或改造动物毛色提供科学依据。

【目的】探索羊驼毛囊干细胞的基本生物学性质，初步阐明MC1R影响毛囊干细胞表达毛色蛋白的机理。探索MC1R质粒转染aHFSCs对毛色基因及毛色蛋白表达的影响，研究RNA干扰法以及IFN-γ、ASIP-YY对羊驼MC1R基因表达量及黑色素合成量的影响。.【方法】⑴取羊驼皮肤样本，获取毛囊干细胞，研究其基本生物学性质。⑵从羊驼皮肤组织中提取RNA，通过双酶切后连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建pcDNA3.1(+)-MC1R重组质粒，转染aHFSCs，检测毛囊干细胞中MC1R的表达。⑶合成针对羊驼黑素细胞中MC1R基因的瞬时干扰siRNA，利用脂质体RNAi-Mate将siRNA反向转染入黑素细胞，提取总RNA，检测MC1R mRNA的相对表达量；通过半定量测定MC1R蛋白的相对表达量，研究siRNA对黑素细胞MC1R基因的影响。⑷研究ASIP-YY对体外培养的黑素细胞黑色素合成的影响。⑸以小鼠成纤维细胞为模型，设计合成三对针对小鼠MEF中MC1R基因的瞬时干扰siRNA，反向转染转染MEF，检测MC1R mRNA和其蛋白的相对表达量。.【结果】⑴从形态学、细胞标志、分化能力等方面研究了羊驼毛囊干细胞的生物学性质。 ⑵构建了pcDNA3.1(+)-MC1R重组质粒。⑶证明脂质体介导的pcDNA3.1(+)-MC1R质粒转染后显著影响MC1R mRNA表达量，而对TYR和MITF mRNA影响差异不显著。⑷证明siRNA对 MC1R 基因有显著抑制作用（P<0.01），其MC1R 黑素合成量极显著低于空白对照组（P<0.01）。⑸证明ASIP-YY对体外培养的羊驼黑素细胞的增殖和黑素合成有着密切的关系。ASIP-YY对各基因mRNA的表达有显著影响。.【结论】⑴初步阐明了aHFSCs的基本生物学性质及MC1R基因在毛囊干细胞中的表达情况及对毛色蛋白的影响。⑵本试验成功克隆了高纯度的真核载体pcDNA3.1(+)-MC1R，并将其转染羊驼毛囊干细胞，初步阐明了MC1R基因在毛囊干细胞中的表达情况及对毛色蛋白的影响。⑶从体外合成的三对特异性siRNA中成功筛选出了对羊驼MC1R抑制效果确实有效的siRNA。⑷证明了不同浓度ASIP-YY黑素细胞中黑色素生成相关基因mRNA表达的影响。