KIT蛋白在羊驼毛囊毛乳头细胞的表达及与毛色关系的研究

毛囊发育和周期性生长的信号途径在人、猪等物种上已取得重要的研究进展，KIT基因是控制毛色的主要候选基因，其突变方式在不同动物中具有不同的遗传效应。羊驼作为一种主要以产毛为主的经济动物，其毛囊发育和毛色形成及与候选基因的关系研究尚为空白。KIT基因对羊驼毛色的影响、分子调控机理及其变异对羊驼毛色所产生的温和多效性影响，国内外报道较少。本研究在课题组已分析羊驼毛囊超微结构及KIT蛋白在不同毛色羊驼毛囊表达差异的基础上，针对毛囊干细胞研究所面临的难点，进一步采用显微分离和消化相结合的方法，分离培养不同毛色羊驼毛乳头细胞，观察其形态特征和生长状况；在此基础上，通过原位杂交与基因转染等技术研究不同毛色羊驼毛囊体外培养细胞中KIT蛋白表达变化及其与毛色的关系，揭示KIT基因通过毛乳头细胞调控羊驼毛色蛋白表达的机理，阐明羊驼毛色形成的分子机制，以期为利用分子生物学技术人工调控或改造动物毛色提供科学依据。

在人、猪等物种上，毛囊发育和周期性生长的信号途径已取得重要的研究进展，KIT基因是控制毛色的主要候选基因，其突变方式在不同动物中具有不同的遗传效应。羊驼作为一种主要以产毛为主的经济动物，其毛囊发育和毛色形成及与候选基因的关系研究尚为空白。课题组在已分析羊驼毛囊超微结构及KIT蛋白在不同毛色羊驼毛囊表达差异的基础上，通过分离原代细胞并鉴定后进行传代培养，同时通过原位杂交与基因转染等技术研究不同毛色羊驼毛囊体外培养细胞中KIT蛋白表达变化及其与毛色的关系。课题组首先采集羊驼背部皮肤组织，用胰酶消化粘连组织，直接于显微镜下取毛囊于加有2% BSA、5 μl/ml胰岛素、0.5 μg/ml氢化可得松、10 ng/ml EGF和10 ng/ml IGF-1的DMEM/F12培养基中进行培养，并于显微镜下观察其形态特征和生长状况，结果显示：新分离的羊驼毛乳头细胞呈长梭型，接种于培养基中1 h后可见一部分细胞贴壁，6 h后开始大量贴壁，但随着培养时间的增长，细胞增殖并呈现聚集生长现象；当细胞快融合时用0.25%的胰蛋白酶37℃消化5 min进行传代培养；传代的细胞呈现多角型，传代后4-5天开始呈对数生长，约2周达到高峰。将分离的毛乳头细胞提取RNA和DNA扩增后测序，发现DNA片断长1280 bp, cDNA长426 bp，intron16与exon17交际处有AG规则，符合分子遗传学的理论；exon2 cDNA长242 bp，编码含75个氨基酸残基的蛋白；与其它物种相似性达90%以上，证实羊驼毛囊毛乳头细胞中表达KIT蛋白。流式细胞仪测定分离的羊驼毛乳头细胞的周期结果显示第一代细胞增殖能力相对较强，随着传代次数增加，细胞的增殖能力下降，细胞生长越来越慢，指数生长期也越来越短，但大部分仍处于静止期，具有一定的增殖能力。原位杂交实验结果显示探针浓度在1:100稀释时较为理想。