MicroRNA调控DNA甲基化对先天性心脏病的发生和干预的功能研究

Congenital heart disease (CHD) is a complex disease, with environmental and genetic factors playing important roles. The molecular mechanisms of CHD include genetics and epigetics. DNA methylation is one of most important epigenetic effect. Manay genes were involved in the signalling pathway of DNA methylation and microRNAs, with correlation with CHD. In this study, CHD clinlic sampls will be well collected. DNA methylation status, expression levels of microRNAs, and their correlation will be analyzed. In cultured myocardial cells or zebrafish in vivo, DNA methylation level or microRNAs expression level will be up- or down-regulated seperately，so as to study 1) effects of their change on differentiation and development of zebrafish cardiobascular system or cultured myocardial cells; 2) effect of microRNAs expression level on DNA methylation ststus; 3) effect of DNA methylation level on expression level of microRNAs; 4）wether manupilation of microRNA expression will inhibit DNA methylation effect. Overall, this study will expand our understanding of roles of microRNAs and DNA methylation on CHD, which will lead us to a better way to control heart development and to prevent CHD.

先天性心脏病的发生机制十分复杂。表观遗传效应和基因遗传效应共同作用而导致先心病的发生。表观遗传效应最重要之一是DNA甲基化，它可影响多个基因的表达，与先心病密切相关。MicroRNA可影响多个基因的表达，并调节不同转录因子，从不同路径影响先心病发生。本研究从先心病病例出发，分析DNA甲基化水平变化和microRNA表达变化的相关性。在心肌细胞水平及斑马鱼整体水平，分别调节microRNA的表达和DNA甲基化水平高低，研究1)对心肌细胞或斑马鱼发育的影响和表型；2）microRNA的表达变化对DNA甲基化水平的影响及机制；3）DNA甲基化水平的变化对microRNA的表达的影响及机制；4）调节microRNA的表达是否可抑制DNA甲基化效应。由此，研究microRNA和DNA甲基化的相互作用在先心病中的作用，探索是否可通过调节microRNA的的表达抑制甲基化效应而达到干预先心病的发生。

miRNA及DNA甲基化在先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）的发生发展中起着重要的作用，它们之间更存在着复杂的相互调控机制。本项目通过对先心病样本进行筛选分析，研究DNA甲基化与miRNA对心脏发育的影响。并在此基础上，探索它们之间的相互作用以及通过调节特定miRNA的表达以达到抑制甲基化效应的目的。研究结果显示（1）CHD患者心脏组织DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase，DNMTs）表达降低。斑马鱼去甲基化处理后可导致死亡率和畸形率增加，生长发育落后，心脏形态和功能异常。体外培养心肌细胞去甲基化后可导致增殖能力降低，心脏关键基因表达紊乱；（2）通过miRNA测序、生信分析及qPCR验证，我们发现miR-29b-3p在患者心肌组织中表达显著增加。斑马鱼注射miR-29b-3p可出现死亡率和畸形率增加、发育迟滞、心脏形态和功能异常、心肌细胞增殖能力降低等。体外培养心肌细胞转染miR-29b-3p可抑制其增殖能力。进一步研究表明miR-29b-3p可通过调控靶基因NOTCH2的表达抑制心肌细胞增殖；（3）患者心肌组织中DNMTs与miR-29b-3p的表达呈负相关。DNMTs可通过改变miR-29b-3p启动子区域的甲基化水平影响其转录，miR-29b-3p可通过直接靶向作用于DNMT3A和DNMT3B的3’ UTR区域抑制其表达。利用两者的调控关系，通过外源性抑制miR-29b-3p的表达，可降低低甲基化对斑马鱼和心肌细胞造成的损害。本研究不仅有助于了解先心病发生发展过程中DNA甲基化和miRNA的作用，更通过外源性改变miRNA的表达，为保护心脏发育、干预先心病发生发展提供新思路。随着干预 miRNA 表达技术不断进步，基于miRNA的治疗策略将成为先心病治疗的重要方向，将其应用于临床具有广阔的前景。