结核分枝杆菌MPT64与Nucleolin调控巨噬细胞凋亡的功能和机制研究

Immunogenic protein MPT64 secreted from Mycobacterium tuberculosis(MTB) is a key virulence factor required for apoptosis resistance. The apoptosis of macrophages (Mφ)was gradually restrained and the expressions of Bcl-2 were increased with the increase in the amount of MPT64. MPT64 antigen was found to interacted with Nucleolin(NUL) by co-immunoprecipitation when MPT64 was incubated with disrupted Mφ. NUL is a multifunctional phosphoprotein,and plays an important role in regulating cell proliferation and apoptosis, and helping viruses to enter into cells. It had been reported that the stability of Bcl-2 mRNA were strengthened when NUL was binded to Bcl-2 3'-untranslated region. The stability of Bcl-2 mRNA was contributed to apoptosis resistance. This is important or not MPT64 excites Mφ and increases NUL to aggrandizing Bcl-2.In this research, we plan to elucidate immune evasion mechanism of MTB drived by secreted protein MPT64, in which MPT64 may be interated with NUL and regulate the expression of Bcl-2.

分泌蛋白MPT64是结核分枝杆菌（MTB）的优势抗原，是引起巨噬细胞（Mφ）凋亡抑制的关键毒力因子。研究发现MPT64通过促进凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，进而抑制Mφ的凋亡，但具体调控机制不清楚。我们前期通过免疫共沉淀及质谱研究发现核仁素（Nucleolin，NCL）是MPT64的特异性结合蛋白之一,且MPT64刺激Mφ可上调NCL和Bcl-2的表达。已有报道NCL可通过结合Bcl-2 mRNA3'非编码区以促进其稳定性，进而抑制Mφ的凋亡。那么MPT64是否通过与NCL的结合进而促进Bcl-2的表达，从而达到抑制Mφ的凋亡作用？本项目拟通过细菌基因敲除，RNAi干扰和免疫荧光共定位技术研究MPT64与NCL的作用方式和结合位点，并阐明其相互作用抑制巨噬细胞凋亡的信号转导机制。这一机制的深入研究对解释MTB逃避宿主免疫防御及致病有重大意义。

分泌蛋白MPT64是结核分枝杆菌（MTB）的优势抗原，是少数几种能在肉芽肿中存在，引起巨噬细胞（Mφ）凋亡抑制的关键毒力因子。其结构特异功能显著，但怎样发挥其功能机制至今不详。本项目立足动物模型和细胞模型，针对性解释其功能机制。本研究发现巨噬细胞中过表达MPT64蛋白能显著抑制其凋亡并延长细胞的存活，尤其在诱导凋亡剂作用下，仍能显著抑制细胞的凋亡。通过免疫共沉和共聚焦显微镜定位技术，发现核仁素蛋白Nucleolin是MPT64效应蛋白，MPT64通过穿膜后聚集于核仁膜附近，诱导Nucleolin蛋白的出核，出核后结合于Bcl-2 mRNA3’非编码区的，阻止了mRNA的降解，检测发现MPT64蛋白可显著提高Nucleolin和Bcl-2蛋白的表达。本研究同时发现过表达MPT64蛋白的耻垢分枝杆菌和大肠杆菌，尾静脉感染小鼠后过表达MPT64蛋白的菌株能显著降低小鼠的死亡率；比较对照小鼠，脏器的细菌载量减少，炎性因子IL1B,IL6,TNF-a和IFN-r等显著降低。显示MPT64蛋白可降低感染小鼠的炎性反应，以提高小鼠的自我保护力。通过MPT64耻垢表达株感染巨噬细胞，同样证实MPT64蛋白有抑制炎性的作用。MPT64蛋白在293T细胞中过表达，共转NF-kB报告系统，结果MPT64蛋白能抑制NF-kB的活性。研究发现单转Myd88激活NF-kB报告系统，但共转MPT64蛋白后，显著降低Myd88的激活作用，显示MPT64可能作用于Myd88来阻止炎性信号的传递。采用蛋白免疫共沉淀技术，证实MPT64蛋白的确能结合Myd88蛋白。因此，MPT64抑制炎性因子的机制是MPT64蛋白通过结合Myd88阻止了NF-kB信号的下一步传递。综上，本研究部分解释了MPT64蛋白在凋亡和炎症抑制两方面的功能机制，即MPT64蛋白通过Nucleolin和Bcl-2起到抑制凋亡功能；通过和Myd88蛋白的相互作用阻止了NF-kB的信号传递，进而抑制了多种炎性因子的表达。本研究部分解释了MPT64蛋白的功能机制，为后期的疫苗研制提供了新的研究思路，也为结核分枝杆菌在凋亡和炎性反应方面提供了新的研究方向。