酿酒酵母蛋白分泌途径与人造纤维小体组装的适配机制的研究

To improve the heterologous protein secretion in Saccharomyces cerevisiae, the most important strategy is secretion pathway engineering. However, different proteins require different engineering strategies. The assembly of cellulosome in Saccharomyces cerevisiae as a new approach for consolidated bioprocess, has been developed wildly recently, and the key factor to improve its hydrolysis efficiency is increasing the cellulases secretion and scaffoldin surface display. In the present work, we plan to study the impact of secretion pathway engineering on the assembly of cellulosome in S. cerevisiae. Through engineering the protein folding, protein trafficking, quality control system and glycosylation, we investigate the impact of secretion engineering to scaffoldin cell surface display and cellulases secretion. Based on this, the cellulosome and its host cells are designed to improve their ethanol production capability from lignocellulose. Our results will contribute to the development of yeast cell factory to produce the ethanol from lignocellulose.

以酿酒酵母为细胞工厂合成分泌外源蛋白，提高蛋白产量的主要策略是对分泌途径各环节的改造。研究表明不同特性的靶蛋白对分泌途径的要求不同，相互间存在适配机制。酿酒酵母表面展示纤维小体是木质纤维素利用统合生物加工过程(Consolidated bioprocessing, CBP) 的新的研究热点，而提高纤维小体基本元件的分泌及表面展示是提高其效率的基础。本项目拟根据脚手架蛋白和纤维素酶等纤维小体基本元件的蛋白结构特点，通过对蛋白折叠、质量控制系统、膜胞运输及糖基化等环节的改造，研究分泌途径对脚手架蛋白展示和纤维素酶分泌的影响，解析纤维小体基本元件与酿酒酵母蛋白分泌途径的适配机制。在此基础上，优化底盘细胞和纤维小体的设计，提高酿酒酵母纤维小体对纤维素的乙醇转化能力。研究结果对推进酿酒酵母作为细胞工厂进行以纤维素为原料合成生物基化合物的研究具有重要的意义。

利用酿酒酵母表面展示纤维小体对于提高纤维素底物生产生物燃料及化合物具有重要的意义，而提高纤维小体基本元件的分泌及表面展示是提高其效率的基础。本项目首先通过蛋白分泌途径的各个环节的改造，提高纤维素酶的分泌及展示效率。研究首次发现蛋白翻译共移位过程的关键原件（Srp14p和Srp54p）的改造可有效提高纤维素酶等异源蛋白以及内源蛋白的分泌。还揭示了糖基化修饰过程中关键甘露糖基转移酶基因OCH1、MNN9提高纤维素酶等蛋白分泌的关键机理并不是由于影响蛋白的糖基化程度而是通过影响蛋白分泌途径关键基因以及细胞壁的完整性。此外，还分析了膜胞运输的不同环节包括从内质网到高尔基体以及从高尔基体到膜胞对不同的纤维素酶的分泌以及表面展示的影响。首次提出膜胞运输环节的改造，对于在细胞壁进行表面展示的蛋白的展示效率的提高也非常重要。在此基础上，利用酿酒酵母内源凝集素系统Aga1p-Aga2p，构建具有高展示及组装效率的酿酒酵母新型纤维小体，提高了酵母直接利用纤维素底物生产乙醇的能力。这些研究结果不仅有利于推进酿酒酵母作为细胞工厂进行以纤维素为原料合成生物基化合物的研究，且对于酿酒酵母合成其他医用及工业用蛋白具有重要的借鉴意义。