双链RNA酶对斜纹夜蛾RNAi敏感性的作用机制研究

RNAi has a very wide range applications in the functional study of genes. It also used in to pest controlling. However, the application of RNAi is quite limited in Lepidopteran insects. It has been reported that double-stranded RNases (dsRNase) in the gut juice and hemolymph of Lepidoptera may degrade foreign dsRNA, which inhibit the activity of RNAi. However, the identification and function of dsRNases has not been clearly reported. Our previous study identified the dsRNases specifically expressed in the gut and hemolymph of Lepidopteran Spodoptera litura. This project will focus on S. litura to study: (1) determination of enzyme activity of S. litura gut and hemolymph dsRNases; (2) Identification of key amino acids and domains affecting dsRNase activities; (3) the effects of SldsRNases on RNAi sensitivity of S. litura by CRISPR/Cas9 technology. This study will clarify the molecular mechanism of Lepidopteran insensitive to RNAi and provide a theoretical basis for improving the effectiveness of RNAi pesticides to Lepidopteran pests.

RNAi在基因功能研究方面具有非常广泛的应用，也是防治害虫的新思路。然而，该技术在鳞翅目昆虫中的应用却受到很大的限制。有报道认为，鳞翅目昆虫肠液和血淋巴中的双链RNA酶（dsRNase）可能具有降解外来dsRNA的作用，从而抑制RNAi的效果，但其dsRNase的鉴定及其功能研究尚无明确报道。我们的前期研究获得了鳞翅目斜纹夜蛾肠道和血淋巴中专一表达的dsRNase，本项目将围绕斜纹夜蛾dsRNase开展下列3个方面的研究：（1）斜纹夜蛾肠道和血淋巴dsRNase酶活性特点研究；（2）影响dsRNase酶活性的关键氨基酸和结构域鉴定；（3）通过CRISPR/Cas9技术，研究SldsRNases对斜纹夜蛾RNAi敏感性的影响。通过研究将阐释鳞翅目昆虫斜纹夜蛾对RNAi不敏感的分子机制，为提高鳞翅目害虫RNAi农药的有效性提供理论依据，具有重要的理论和应用意义。

RNAi在基因功能研究方面具有非常广泛的应用，也是防治害虫的新思路。然而，该技术在鳞翅目昆虫中的应用却受到很大的限制。有报道认为，鳞翅目昆虫肠道和血淋巴中的双链RNA酶（dsRNase）可能具有降解外来dsRNA的作用，从而抑制RNAi的活性。本研究拟开展斜纹夜蛾和家蚕dsRNase对RNAi效率的影响。本项目的主要研究内容和结果如下：（1）斜纹夜蛾和家蚕肠道消化液和血淋巴均具有很强的双链RNA酶活性，通过RNA-pulldown、组织表达谱分析以及结构域分析和进化分析，得到了斜纹夜蛾血淋巴和肠道特异dsRNases；（2）通过测定dsRNase酶活性，发现其最适PH不同，可能为了适应不同理化环境；（3）CRISPR/Cas9敲除dsRNase后，血淋巴和肠液降解dsRNA的活性下降，家蚕中RNAi敏感性提高。这些研究成果可以加深对dsRNase功能的了解，建立RNAi敏感的斜纹夜蛾或家蚕品系，为利用RNAi技术进行鳞翅目害虫防治提供理论支持。