MicroRNA在电离辐射诱导的肿瘤细胞自噬性死亡中的作用及其表观遗传学调控

放射治疗是肿瘤治疗的重要手段，其机制除诱导肿瘤细胞发生凋亡外，近年来又发现一种辐射致自噬性细胞死亡现象，其机制尚不完全清楚。本研究区别于以往从编码基因调控自噬入手的研究策略，以非编码基因microRNA为切入点，并结合表观遗传学调控来探讨自噬性细胞死亡的机制。首先建立辐射诱导自噬的细胞模型，在模型中筛选差异表达的microRNA并确定其作用的靶基因，进而研究靶基因DNA甲基化水平及组蛋白甲基化、乙酰化状态；同时采用药物调整表观遗传状态以观察对microRNA及其靶基因的影响，阐明microRNA在电离辐射诱导肿瘤细胞自噬性死亡过程中的作用。本研究不但有利于揭示自噬性死亡的机制，而且通过表观遗传对microRNA的调控可以提供新的肿瘤生物标记、发现新的肿瘤治疗靶点，有助于研究新的基于microRNA的肿瘤诊断和治疗策略。

目的 自噬是一种由溶酶体介导的细胞分解过程，或导致细胞死亡，或引发适应性反应而维持细胞存活。本研究旨在探讨辐射诱导自噬过程中miRNA及表观遗传学的调控作用。方法 采用基因工程构建载体，荧光素酶实验检测miRNA与靶结合活性，集落形成、CCK8法检测细胞活力，定量RT-PCR、免疫荧光法和Western blot检测基因和蛋白，流式细胞术检测细胞死亡和周期。结果（1）辐射诱导自噬性细胞死亡：辐射在乳腺癌（MCF-7和MDA-231）、结肠癌（HCT116）中诱发自噬性死亡，出现自噬性囊泡、MAPLC3 II型转化及再定位。（2）辐射敏感基因及敏感miRNA筛查：在MCF-7中经4 Gy、8 Gy照射后，分别有160个、236个基因发生改变，包括Beclin、DRAM、ATM（经Q-PCR实验证实）；分别有53个、35个miRNA发生改变，其中miR-199a、miR-18a、miR-21等经实验证实。（3） miRNA对靶基因的双重调控：设计pri-miR载体及靶基因3’-UTR载体，经荧光素酶及Western blot检测发现miR-199a-5p、miR-18a对靶基因存在双重调控，即除了发挥基因沉默作用（miR-199a-5p在MCF-7中下调Beclin1和DRAM）外，miRNA还具有基因活化作用，如在MDA-231中miR-199a-5p上调Beclin1和DRAM、在HCT116中miR-18a上调ATM。（4）miRNA对自噬的调控：在MCF-7中外源性miR-199a-5p通过下调Beclin1和DRAM进而抑制自噬，在MDA-231中miR-199a-5p则上调Beclin1和DRAM从而促进自噬；在HCT116中miR-18a通过上调ATM进而抑制mTORC1使P70S6K去磷酸化从而促进自噬，miRNA上调作用与辐射改变细胞周期有关。（5）表观遗传学研究：辐射上调MCF-7中DNMT1表达，在MDA-231中下调其表达，给予自噬抑制剂3-MA后均发生逆转，表明自噬能够促进辐射对DNMT1表达的调控；辐射在MCF-7中下调HDAC3表达，给予3-MA后发生逆转，在MDA-231中辐射及3-MA作用后HDAC3无变化。结论 在辐射诱导的自噬调控中miRNA依细胞类型不同发挥双重调控作用，DNMT1和HDAC3的作用还取决于其所调控的抑癌基因。