表观遗传与microRNA共同诠释SCF/c-kit/Slug信号通路调控涎腺腺样囊性癌侵袭转移的分子机制

嗜神经侵袭和远处转移是影响涎腺腺样囊性癌（ACC）预后的主要因素。最新研究表明，表观遗传和miRNA为阐明肿瘤侵袭转移分子机制提供新的视野。本课题组在前期研究发现SCF/c-kit/Slug信号通路在ACC侵袭转移中发挥重要作用的基础上，拟从表观遗传和miRNA相互作用角度进一步诠释SCF/c-kit/Slug信号通路调控ACC侵袭转移的分子机制。主要研究内容包括：①采用miRNA微阵列、生物信息学、荧光素酶报告基因、基因导入、RNAi等方法研究SCF/c-kit/Slug信号通路调控ACC侵袭转移上下游关键miRNAs网络调控机制。②采用前体miRNA和RNAi增强和抑制这些关键miRNAs，研究其对DNA甲基化关键酶表达及ACC侵袭转移影响。③采用MSP、ChIP、LC-MS/MS等技术研究表观遗传对关键miRNAs表达及ACC侵袭转移影响。研究结果将为防治ACC侵袭转移提供新的思路。

研究表明，多种恶性实体瘤中酪氨酸激酶受体c-kit表达异常升高，c-kit在肿瘤侵袭转移中扮演重要角色。本研究探讨c-kit/Slug信号通路对涎腺腺样囊性癌侵袭转移特性的影响，初步阐明c-kit/Slug信号通路在涎腺腺样囊性癌侵袭转移中的作用机制，为涎腺腺样囊性癌侵袭转移提供理论依据和实验基础。首先，采用慢病毒载体pLVX-AcGFP1-N1 vector过表达载体和pLVX-shRNA vector RNAi表达载体，成功构建c-kit、Slug过表达，以及靶向c-kit、Slug基因shRNA慢病毒表达载体。并将其转染到涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-M和ACC-2，建立稳定表达的细胞株。其次，采用MTT法、细胞划痕实验和细胞侵袭实验，结果显示c-kit特异shRNA表达载体能有效抑制涎腺腺样囊性癌细胞ACC-M和ACC-2体外增殖、迁移和侵袭能力；在涎腺腺样囊性癌移植瘤模型上，c-kit shRNA组裸小鼠生长明显被抑制。同时，伴随c-kit的表达沉默，肿瘤组织内转移密切相关基因Slug、N-cadherin、MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白的表达也同时被降低；在涎腺腺样囊性癌肺转移模型上，c-kit shRNA组裸小鼠肺转移明显被抑制。提示：SCF/c-kit/Slug信号通路促进了ACC的侵袭转移。然后，探讨SCF/c-kit/Slug信号通路调控ACC侵袭转移的分子机制，结果发现， c-kit 能够诱导ACC发生EMT，是EMT的转录因子之一，在TGF-ß诱导的EMT中发挥重要作用；高表达c-kit的ACC细胞株中筛选出表达差异的miRNAs分子51个，其中上调表达21个,下调表达30个。选取miR-29a进一步研究，发现miR-29a通过表观遗传改变调控ACC的侵袭转移。最后，在临床标本上验证了上述实验结果，c-kit和Slug在人SACC组织中高表达，与ACC侵犯神经、局部复发以及远处转移显著相关；miR-29a甲基化状态在SCF/c-kit/Slug信号通路调控ACC侵袭转移中发挥重要作用。综上所述，本课题在体外细胞、体内动物模型和临床标本上，分别证实，c-kit/Slug信号通路在涎腺腺样囊性癌的侵袭转移中发挥着重要作用，为临床上采用靶向c-kit防治涎腺腺样囊性癌侵袭转移提供了重要的理论依据和实验基础。