基于图像融合与三维重建的压电超声细胞显微注射技术机理及方法研究

The rapid development of biomedicine has proposed a higher requirement for the accuracy and success rate of cell microinjection technology. Until quite recently most pratical cell microinjection has still been performed on the basis of manually operation and rely heavily on empirical judgments of professional operators. The low success rate and poor reproducibility lagged far behind the demands of fast developed modern biomedicine. This project aims at the goal of high-precision and minor injured cell microinjection, to carry out research on theory and method of piezo-driven ultrasonic cell microinjection technology based on microscopic image fusion and three-dimensional reconstruction. Firstly using the real-time three-dimensional reconstruction technique based on the registration fusion of polarized light and confocal microscope image,to build a precision three-dimensional model of operating cells that including visible and invisible structures and provide navigation for high-precision auotmated cell microinjection. Then on this basis, in-depth research will be proceeded on the theory of minor injured piezo ultrasonic microjection technology through ultrasonic elliptical vibration cutting theory, which will realize the optimization setting of piezo-driven microinjection parameters, and achieve the objects with minor damage to the operating cells and high survival rate. Further, new piezo-driven ultrasonic microinjection device will be designed and developed, and experimental research on assisted reproduction,stem cell nuclear transer and other related test applications will be carried out. The research results of this project will greatly enhance the level of the microinjection technique and have important theroytical and practical significance for the promotion of many biomedical research fields such as the transgenic technology, assisted reproduction and stem cell research, etc.

生物医学的飞速发展对细胞显微注射技术的精确性和成功率提出了更高要求。当前细胞显微注射技术建立在人工操作和经验判断的基础上，成功率低、可重复性差，远远落后生物医学领域需求。本项目从高精密微损伤细胞显微注射目标出发，开展基于显微图像融合和三维重建的压电超声振动细胞显微注射技术机理和方法研究。利用偏振光和共聚焦显微镜图像融合的细胞实时三维重建技术，构建被操作细胞包括显性和隐性结构的精确三维模型，为高精密的自动化细胞显微注射导航。分析毛细显微针振动模态，利用椭圆振动切削理论，深入研究微损压电超声振动显微注射机理，用于压电显微注射参数的优化，达到操作细胞微损伤、高存活率的目标。设计并研制新型压电超声振动细胞显微注射装置，开展人工辅助生殖、干细胞核移植等相关试验应用研究。本课题研究成果将极大提高细胞显微操作技术水平，对促进我国转基因、人工辅助生殖、干细胞研究等生物医学领域发展具有重要的理论和现实意义。

本课题从现代生物医学技术研究需求出发，重点研究需要高精度和微损伤以达到高存活率的细胞显微操作技术的实现机理和新型操作方法。其主要研究成果在以下三个方面：.1.基于偏振光图像融合的细胞隐性结构可视化方法研究，（1）研究了光学倒置显微镜和偏振光系统的成像原理，提取用于图像配准的显著特征，完成两系统源图像的相对配准；（2）在精确配准基础上，研究提供全面细致信息的像素级图像融合方法，并结合细胞“显性”、“隐性”结构成像特征，提取卵母细胞多个ROI区域，提出清晰呈现小鼠卵母细胞结构特征的图像融合算法；（3）利用Nikon Ti-E生物倒置显微镜和Abrio圆形偏振光成像系统进行卵母细胞图像融合实验，实现遗传物质载体—纺锤体的良好定位，在图像信息融合基础上提取透明带ZP特征，测量透明带厚度ZPT，检测卵母细胞发育状况。 .2.基于压电超声振动的微创化细胞破壁方法研究，（1）针对超声技术的特性，研究了超声破膜、切割原理，确定了最佳超声破膜参数，为压电注射器的设计提供理论依据。（2)在分析压电陶瓷特性及振动原理基础上，设计了压电陶瓷封装方式以及压电注射器的安装形式。（3）在传统注射装置的基础上，提出了单点固定、两点固定和尖嘴式注射结构三种设计方案。利用ANSYS软件对结构建模及谐响应分析，分析不同频率下注射针尖的横向振动情况，最终确立了两点支撑新型注射装置的初始构型。对设计结构尺寸优化，最终加工出压电注射器实物。（4）对小鼠卵细胞进行了细胞破壁实验。通过系列对比实验，得到最佳破膜参数，可实现84%的细胞破壁成功率。.3.基于旅波电路的细胞定点化操作方法研究，（1）创新性地提出了一种基于介电泳配合微针拨动的细胞三维位姿调节策略，可有效降低细胞操作过程中受到的损伤，并提高位姿调节的效率和精度。（2）对粒子极化理论进行了分析研究，给出了理想微球在电场中所受传统介电泳力、行波介电泳力、电旋转介电泳力矩的计算方法。在此基础上，研究了介电泳芯片中细胞的受力情况和运动情况。基于生物粒子单层匀质球形简化模型，建立了细胞介电泳模型。（3）基于前述理论研究的基础上，设计了细胞位姿调节芯片。并应用COMSOL Multiphysics软件建立了电场仿真模型和细胞运动仿真模型，对芯片中的电势分布，介电泳因数分布以及细胞运动轨迹等进行了仿真分析，得出了合理实验参数；（4）设计实验对细胞位姿调节方法进行论证。