硫酸酯酶对红藻琼胶可控酶法脱硫的分子机制研究

Agar of different electroendosmosis were applied in different industry fields including food, pharmacy, chemical, and different research fields including bioseperation, molecular biology, etc. The method of alkaline treatment followed by bioseperation was adopted in discarding agaropectin, in which way the electroendosmosis of agar was decreased. This research will use controlled-enzymatic method to desulfate agar to prepare agar products with different electroendosmosis. This research will be carried out based on two strains of Vibrio sp. QD-9 and Agarivorans albus YKW-34, which could desulfate agar. The purification, gene cloning, recombinant expression, kinetics of enzyme-catalyzed reactions against different substrates of sulfatases from these strains will be carried out and the mechanism of desulfate of agar by them will be studied. A new method for controlled desulfation of agar will be provided by this research, which will establish a new theory of enzymatic desulfation of agar. This theory has important practical value in production of agar with different gel strength and electroendosmosis.

不同凝胶强度及电内渗值的琼胶在食品、医药、化工等应用领域及生化分离、分子生物学等研究领域有着重要的用途。目前常用碱预处理及化学分离方法去除琼胶中的硫琼胶，以提高琼胶的凝胶强度并降低其电内渗。本研究探索采用酶法特异性地可控脱除硫琼胶分子中的硫酸根，以制备不同凝胶强度及电内渗值的琼胶。本研究将以两株自行筛选出的微生物Vibrio sp. QD-9和Agarivorans albus YKW-34为出发点，对其所产琼胶硫酸酯酶进行分离纯化、基因克隆及重组表达，对琼胶硫酸酯酶的酶学性质及针对不同底物的酶促动力学性质进行研究，利用基因的生物信息学分析技术，阐释其对琼胶分子中硫酸根酶解的分子机制。该研究为琼胶中硫酸根的可控脱除提供一种全新的思路，创新性地建立琼胶的酶法脱硫理论，在不同凝胶强度及电内渗值的琼胶制备方面具有重要的应用价值。

不同品质琼胶在食品、医药、化工等应用领域及生化分离、分子生物学等研究领域有着重要的用途。目前常用碱预处理及化学分离方法去除琼胶中的硫琼胶，以提高琼胶的凝胶强度。本研究采用酶法特异性地可控脱除硫琼胶分子中的硫酸根，以制备不同凝胶强度的琼胶。从青岛海域红藻中筛选出一株能高效分泌芳基硫酸酯酶的菌株，经生理化特征及16s rRNA鉴定为海单胞菌属，命名为Marinomonas sp. FW-1。采用了单因素-响应面方法对菌株产芳基硫酸酯酶的培养条件及培养成分进行优化。结果表明，其最佳培养基组分为（w/v）：0.2%琼胶，0.2%酵母膏，0.5%蛋白胨，2.89%NaCl，0.412%MgCl2·6H2O，0.1% KCl，0.02% CaCl2，0.013% K2HPO4·3H2O，0.002% FeCl2·4H2O，0.09% MnCl2，0.043%焦磷酸钠，1.87%吐温-80。最佳培养条件为pH7.0，培养温度为35℃，接种量1%，发酵时间为72h。通过阴离子交换和凝胶色谱进行了FW-1产芳基硫酸酯酶的分离纯化，其回收率为13%，纯化倍数为12。SDS-PAGE结果表明此酶由单一肽链组成，分子量为33kDa。此酶的最适pH9.0，在pH 8-11稳定；最适温度为45℃，低于55℃稳定。此酶对石花菜和江蓠琼胶的硫酸根脱除率分别为86.11和89.61%，酶处理后的琼胶与市售琼胶品质相当。琼胶是由不含有硫酸根的琼脂糖和含有硫酸根的硫琼胶组成，本研究通过EDTA-2Na方法从江蓠和石花菜提取硫琼胶，分析其酶作用前后结构的变化推断其脱硫机制。经HPLC和GC分析，硫琼胶由α-3,6-AG和D-半乳糖交错构成。江蓠硫琼胶含有66.1%半乳糖和33.9%3.6-AG，分子量为4.8×105g/mol；石花菜硫琼胶含有58.2%半乳糖、29.8% 3,6-AG、8.5% 2-甲基-3,6-AG及3.5%木糖，分子量为7.3×104g/mol。经GC-MS及NMR分析江蓠和石花菜硫琼胶均含有4-硫酸-D-半乳糖、6-硫酸-D-半乳糖及6-硫酸-L-半乳糖，此外石花菜硫琼胶还存在2-甲基-3,6-AG及丙酮酸基团取代。酶作用前后多糖结构差异结果表明芳基硫酸酯酶可以有效脱除D-半乳糖的C-4及C-6上和L-半乳糖的C-6的硫酸基。芳基硫酸酯酶脱除机理可为制备不同品质的琼胶提供理论基础。