杆状病毒DNA聚合酶入核机理的研究

Baculovirus were widely used in biopesticide, protein expression and vaccine production. Most of baculovirus proteins were involved in baculovirus DNA replication and assembly, these proteins express in cytoplasm and are transported into nucleus. However, it is unclear how the proteins were imported into nucleus. In this work we will focus on the several issues using immunofluorescence, peptide fusion, multiple point substitution, deletion mutation and yeast two-hybrid system :(1) nuclear localization signals of baculoviru DNA polymerase; (2) the clones of importin in Sf-9 cells; (3) the interaction between nuclear localization signal and importin. The results will contribute to the understanding of nuclear transport of baculovirus proteins.

杆状病毒被广泛应用于生物农药、蛋白质表达以及疫苗生产。杆状病毒的多个蛋白在细胞质翻译后转运到细胞核，参与病毒的复制和装配，但是，这些蛋白从细胞质进入到细胞核这一过程仍不清楚。本申请项目以杆状病毒的DNA聚合酶为研究对象，通过荧光免疫、肽融合、位点缺失和突变、酵母双杂交等实验方法，开展以下方面的研究：（1） 杆状病毒DNA聚合酶核定位信号的研究；（2）Sf-9细胞输入蛋白的克隆；（3）DNA聚合酶核定位信号与Sf-9细胞输入蛋白相互作用的鉴定。这些研究将对理解杆状病毒蛋白的入核机理具有重要意义。

杆状病毒被广泛应用于生物农药、蛋白质表达以及疫苗生产。杆状病毒的多个蛋白在细胞质翻译后转运到细胞核，参与病毒的复制和装配，但是，这些蛋白从细胞质进入到细胞核这一过程仍不清楚。本申请项目以AcMNPV的DNA聚合酶为研究对象，开展了以下方面的研究：（1）杆状病毒DNA聚合酶核定位信号的鉴定以及替代的研究。通过生物信息学分析﹑肽融合以及位点突变等实验，鉴定了 α﹑β与γ杆状病毒DNA聚合酶核定位信号；通过不同类型DNA聚合酶的替代，鉴定了α﹑β与γ杆状病毒DNA聚合酶功能之间具有差异。（2）杆状病毒DNA聚合酶N末端的研究。通过截断以及位点突变分析等实验，鉴定了N末端的二级结构以及四个基序对杆状病毒DNA聚合酶的稳定性﹑病毒复制及其核定位具有显著的影响；（3）杆状病毒核仁定位信号对蛋白核定位影响的研究。生物信息学分析发现DNA聚合酶﹑LEF5等多个蛋白带有核仁定位信号，免疫荧光分析﹑基因敲除﹑位点突变等实验证实核仁定位信号对病毒产量及多角体合成具有显著的影响；（4）Sf-9细胞中核输入蛋白的克隆。通过转录组学分析鉴定并克隆了4个核输入受体基因；（5）DNA聚合酶核定位信号与核输入蛋白相互作用的鉴定。酵母双杂交以及双分子荧光实验证实3个核输入受体与核定位信号存在相互作用。这些研究结果对理解杆状病毒蛋白的入核机理以及病毒的复制具有重要意义。