病程相关基因非表达子的活化模式及其在采后葡萄果实诱导抗病中的作用机理研究

NPR1 protein is recognized as both an upstream receiving point of signal transduction and a downstream starting point of PR genes expression and resistance related substances biosynthesis, thus playing a key regulatory function. To data, the models of activation and modes of action of NPR1 protein involved in induced resistance are still unclear in postharvest fruits. Based on the previous research findings, the activation modes and regulation mechanisms of functional NPR1 protein associated with the different patterns of disease resistance induced (Direct induced resistance or Priming) by the elicitors such as BTH or MeJA are investigated from three layers of molecular, cell and fruit levels in grape berries, which were served as the core contents. Beginning with the analysis of the biological activities of grape VvNPR1.1 protein, the present project is to investigate the effects of the exogenous elicitors or endogenous signal molecular on the cellular redox and its influence on sulfhydrylation of VvNPR1.1 protein, and to determine the subcellular localization under different conformation of VvNPR1.1 protein, and finally to interpret the interaction between VvNPR1.1 protein and TF vTGA2.2 and their effects on expression of PRs gene, which will lead to elucidate the critical point of NPR1 protein involved in different modes of induced resistance networks in grape berries. This study will help to improving the theory of induced resistance in postharvest fruits and vegetable.

NPR1蛋白在植物诱导抗病网络中居于上游信号分子传导接受位点并处于下游PRs基因表达和抗病相关物质合成起始点，具有关键的调控作用。但目前NPR1蛋白在采后果实诱导抗病中的活化模式和作用机制仍不清楚。因此，本项目拟在前期研究成果基础上，以葡萄果实为试材，从分子、细胞和果实三个层次开展研究，以激发子（BTH或MeJA）诱导采后葡萄果实不同模式抗病反应（直接诱导作用或Priming反应）中功能性VvNPR1.1蛋白活化机制和调控机理为核心研究内容，从分析葡萄VvNPR1.1蛋白生物活性入手，研究外源激发子或内源信号分子对葡萄细胞还原势的调节作用及对VvNPR1.1蛋白巯基化的影响，明确VvNPR1.1蛋白不同构象下的亚细胞定位，再解析VvNPR1.1蛋白与转录因子vTGA2.2互作及其对PRs基因表达的影响，从而阐明NPR1蛋白在葡萄果实诱导抗病网络中的关键位点作用，完善采后果蔬诱导抗病理论。

激发子诱导的果实采后抗病性反应可有效抑制贮藏期间果实腐烂发生和品质劣变，但果实诱导抗性的信号传导通路和表现模式较为复杂，难以从全局上把握不同模式的果实防卫反应。NPR1蛋白在植物诱导抗病网络上居于上游信号分子传导的接受位点并处于下游PRs基因表达和抗病相关物质合成的起始调控点，对其开展研究有助于从整体上解析果实采后诱导抗病网络。本研究以葡萄果实为试材，研究激发子（BTH、MeJA和BABA）诱导的葡萄果实抗病性反应中细胞还原势对葡萄 NPR1 蛋白的活化作用和亚细胞定位的影响，并分析转录因子VvTGA与 VvNPR蛋白互作及对PRs基因表达的调控作用，以明确NPR1在诱导抗性中的关键节点作用。结果显示，激发子处理可先通过启动葡萄果实或细胞中活性氧迸发来使果实处于敏化状态，Botrytis cinerea接种则进一步诱导果实抗坏血酸-谷胱甘肽循环、磷酸戊糖途径以及抗氧化酶系统中关键基因表达丰度的上调，从而积累还原型物质，促使还原势上升。因受到还原势上升的影响，果实中NPR1蛋白则从无活性的多聚体状态转变为活性单体，并跨膜转运至细胞核中，进而与转录因子TGA1互作，从而获得结合PRs基因as-1元件的功能，最终诱导PRs基因的表达，使果实展现抗病性。与TGA1转录因子的修饰作用类似，我们同时发现含有W-box结构域的WRKY18转录因子和热激蛋白HSP24均具有结合NPR1蛋白并使其具有启动PRs基因的能力，且WRKYs转录因子具有对NPR1蛋白和其他功能性基因的双重激活作用，如WRKY18可结合葡萄NPR1蛋白和植保素合成关键基因STSs，从而全面启动果实防卫反应；而WRKY40对NPR1蛋白和蔗糖代谢相关酶的调控作用，促使果实糖代谢趋向逆境响应。此外，高浓度激发子处理诱导的直接抗性反应在激活葡萄果实抗病性反应的同时对葡萄果实品质造成负面影响；低浓度激发子处理诱导的Priming反应则兼具平衡抗病性和品质维持的双重作用。这些结果表明，Priming反应可能是果实表现诱导抗病性的普遍模式，而对NPR1蛋白修饰和活化作用则是抗病性反应的重要前提。相关研究从NPR1活化的角度对葡萄果实诱导抗病性网络进行了全景式描绘，有助于完善果蔬诱导抗性理论；并对新型保鲜果蔬激发子的开发提供了评价参照，也强调了激发子安全施用剂量的重要性。