南方根结线虫效应蛋白Mi-V86抑制植物免疫分子机制研究

Root-knot nematode Meloidogyne incognita is one of the most important plant parasitic nematodes and causes serious damage to agricultural industry in the world. The nematode effectors secreted into the host plants during its infection are proven to play key role in successful parasitism. The effector Mi-V86 from M. incognita is a novel candidate member of the venom allergen-like protein family. Our preliminary results demonstrated that Mi-V86 can suppress the effector-triggered immunity (ETI), and interact with Nicotiana tabacum NtRNF14 which encodes an E3 ubiquitin-protein ligase. In order to elucidate clearly the function of Mi-V86 during the nematode infection process, the spatial and temporal transcription patterns of Mi-V86 will be analyzed using in situ hybridization and RT-qPCR, then the virulence of Mi-V86 during M. incognita infection will be examined by the virus-induced gene silencing and the overexpression in transgenic plants. Meanwhile the interaction between Mi-V86 and NtRNF14 will be confirmed in vitro and in vivo using the Pull-down and Co-IP technique, respectively. In order to clarify the function of NtRNF14 in manipulating the plant immunity, the E3 ligase activity of NtRNF14 will be evaluated and its involvement in ubiquitinating Mi-V8 through the ubiquitin-proteasome pathway will be confirmed. The results will demonstrate that the cytoplasmic effector Mi-V86 of M. incognita may manipulate the plant immunity by interacting with the host E3 ligase that involved in ubiquitin-26S proteasome pathway, so as to improve our understanding of the interactions between nematodes and host plants, and benefit to the designing of new control strategies for nematode diseases.

南方根结线虫是严重危害农业生产的一种植物病原生物，效应蛋白在线虫成功寄生植物过程中具有重要的作用。Mi-V86是从南方根结线虫中新发现的一种类毒液过敏原蛋白，前期工作已证实该效应蛋白能够抑制ETI反应且与烟草中的E3泛素连接酶蛋白NtRNF14互作，本项目拟采用原位杂交和定量PCR技术检测Mi-V86的时空表达模式；利用病毒介导的基因沉默和转基因过表达研究其在线虫寄生过程中的作用；借助Pull-down和Co-IP技术验证Mi-V86与NtRNF14在离体和活体条件下的互作；明确NtRNF14在植物免疫调控中所具有的功能，测定NtRNF14的E3泛素连接酶活性并验证其参与Mi-V86的泛素化修饰及代谢过程，研究结果将有望证实南方根结线虫能够利用自身分泌的效应蛋白，通过与E3泛素连接酶互作从而调控泛素/26S蛋白酶体介导的植物免疫，为深入揭示线虫与植物互作的分子机制提供理论依据。

根结线虫能够寄生上千种植物，每年给全世界农业生产造成了巨大的经济损失。已证实根结线虫通过分泌效应子进入植物细胞，从而抑制植物免疫并促进线虫寄生。本项目致力于研究一个全新的线虫效应子MiV86的功能，并揭示其在线虫寄生过程中作用机制。项目前期的工作发现该效应子抑制植物ETI，并且已初步证实其与三生烟中编码E3泛素连接酶的蛋白NtRNF14互作。本项目的主要研究内容包括利用原位杂交和定量PCR分析MiV86在线虫体内的转录位点以及发育表达图谱，利用病毒诱导的基因沉默和转基因过表达等方法测定MiV86对线虫寄生的影响，同时进一步验证效应蛋子MiV86与植物E3泛素连接酶的互作，并测定效应子对植物靶标及其介导的植物免疫的影响。. 本项目的研究结果证实效应子MiV86主要在线虫的亚腹食道腺表达，并且在线虫寄生阶段表达上调，同时通过免疫组化揭示线虫寄生过程中能够分泌MiV86蛋白进入植物细胞。沉默MiV86基因的表达能够显著影响线虫的寄生，而在烟草中转基因过表达MiV86则明显抑制flg22激发的PTI相关反应，同时抑制多种激发子引起的植物细胞程序化死亡。与此同时，MiV86能够与NtRNF14在模式植物本氏烟及园艺作物番茄中的同源蛋白RNF217互作，离体泛素化分析进一步证实NbRNF217是一类功能性的E3泛素连接酶，并且其第233位半胱氨酸对于酶活至关重要。在烟草中瞬时表达NbRNF217显示该蛋白负调控植物免疫，而当敲除NbRNF217时则能够显著降低烟草突变体对南方根结线虫的敏感性。此外，NbRNF217被证实在植物中会被26蛋白酶体途径和液泡相关途径降解，而当效应子MiV86与靶蛋白NbRNF217共表达是则能够显著抑制后者的泛素化并提高其蛋白稳定性。. 综上所述，本研究揭示了一种全新的线虫寄生机制，首次证实南方根结线虫利用效应蛋白靶向并稳定植物中一种感病因子RNF217，从而抑制植物免疫以利于线虫寄生。该研究结果在增进我们理解线虫与植物互作机理的同时，也为今后通过遗传育种手段防控植物寄生线虫提供了潜在的靶标。