拟禾本科根结线虫效应蛋白MgGPP抑制植物防卫反应的机理研究

Root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) are one of the most damaging plant-parasitic nematodes, which could secrete effectors to suppress the defence of plants to enable successful infection. Applicant had identified a novel Meloidogyne graminicola effector MgGPP, which is important for nematode parasitism. MgGPP is secreted into host tissues and is subjected to glycosylation in concert with proteolysis in rice to suppress plant defenses and promote parasitism. While, the mechanism between MgGPP and host has not been thoroughly studied. In this project, applicant had proved MgGPP interaction with host rice OsHin1 using yeast-two hybrid system. And on this base this project will further evidence to support their interaction area through BiFC 、Co-IP and MgGPP modifier locus mutation methods. In the meanwhile,CRISPR-Cas9 technology system, gene complementary experiment and over-expression technology will been used to study the effects of OsHin1 on nematode infection. Finally, Gus system and tanscriptome technology will been used to study the effects of OsHin1 on nematode recognition and host's defense system. This project will further elucidate that the relationship of MgGPP and OsHin1, and the mechanisms of suppressing host defence by MgGPP proteins from Meloidogyne would be known.

根结线虫是一类重要的植物病原线虫，其食道腺分泌效应蛋白能抑制寄主的防卫反应。申请人前期研究已鉴定到一个拟禾本科根结线虫效应蛋白MgGPP，MgGPP能利用寄主的翻译后修饰途径对自身进行糖基化和水解修饰而激活其抑制寄主防卫反应的能力。然而，MgGPP与寄主互作的机理仍然未知。申请人已采用酵母双杂技术证明MgGPP与寄主水稻的OsHin1蛋白互作。在此基础上，该项目进一步通过BiFC、Co-IP和MgGPP修饰位点突变方法研究MgGPP与OsHin1相互作用以及翻译后修饰对其互作的影响。同时，采用CRISPR-Cas9技术，基因互补和过表达方法研究OsHin1对线虫寄生能力的影响。最后，利用Gus系统和转录组技术研究OsHin1对线虫侵染的识别和对寄主防卫系统的调控作用。本研究有望明确MgGPP与OsHin1之间的互作关系，从而进一步揭示根结线虫效应蛋白MgGPP抑制寄主免疫反应的分子机理。

植物寄生线虫能够分泌效应蛋白来抑制寄主的免疫反应，从而促进线虫的寄生。我们前期的研究证明，拟禾本科根结线虫分泌效应蛋白MgGPP到水稻细胞的质外体中，然后在效应子C端的帮助下进入到水稻细胞内质网中，在内质网中N端发生糖基化，同时C端被水解，接着修饰后的MgGPP被输送到细胞核中。并且，只有糖基化修饰的MgGPP才具有抑制植物防卫反应的功能。然而，MgGPP如何抑制寄主免疫反应的作用机理还有待深入研究。本研究通过MgGPP蛋白突变体，证明了MgGPP在蛋白的N端存在一段核定位信号肽（NLS）。MgGPP通过这一段NLS把其运送到植物细胞核中。同时，通过烟草瞬时表达系统证明了植物细胞核是MgGPP发挥抑制植物免疫功能的重要场所。接着，本研究利用酵母双杂交技术得到MgGPP的水稻靶标蛋白OsHin1,并通过免疫共沉淀和双分子荧光互补实验证明了MgGPP能够直接与OsHin1蛋白相互作用。Western blot结果证明，糖基化的MgGPP能够增强MgGPP与OsHin1的相互作用。通过Gus系统和qRT-PCR技术，证明了水稻OsHin1能够特异性识别拟禾本科根结线虫的侵染，在线虫侵染过程中具有调控作用。进一步，利用CRISPER-Cas9基因编辑技术和转基因过表达方法，明确了OsHin1对拟禾本科根结线虫具有抗性功能。最后，本研究通过RNA-seq的方法，证明MgGPP和OsHin1能够共同调控多个水稻NBS-LRR等抗性基因。本研究在前期的研究基础上，继续深入研究MgGPP与寄主水稻的相互作用，阐明了拟禾本科根结线虫效应蛋白MgGPP抑制寄主免疫系统的的分子机理。同时，OsHin1的抗线虫功能的研究和发现，为开发拟禾本科根结线虫抗线虫植物提供重要的理论基础及技术平台。