RNA干扰沉默糖原合成激酶3β对tau蛋白磷酸化的作用研究

阿尔茨海默病(AD)是以进行性认知功能障碍为特征的神经变性疾病，老年斑和神经元纤维缠结(NFT)是其特征的病理性损伤。异常磷酸化的tau蛋白构成NFT的核心，目前认为tau蛋白过磷酸化使微管稳定功能受损、螺旋状纤丝（PHF）形成及神经元丢失。因此阻断tau蛋白过磷酸化应是AD治疗的有效途径之一。有研究证明糖原合成激酶-3β（GSK-3β）是导致tau蛋白过磷酸化的重要激酶之一。本研究通过构建稳定转染靶向GSK-3β的siRNA真核表达载体的人SH-SY5Y细胞系，探讨在细胞水平对tau蛋白磷酸化作用的影响。通过AD大鼠模型的建立，探讨siRNA沉默GSK-3β在体外实验对海马神经元病理是否有影响，是否抑制tau蛋白过磷酸化，进一步了解AD的发病机制，为探索AD基因治疗途径提供理论依据。

该课题从细胞水平及动物实验水平探讨了RNA干扰沉默糖原合成激酶3β对tau蛋白磷酸化的影响。创新性地构建靶向GSK-3β的慢病毒表达载体，经酶切和测序鉴定，将慢病毒重组载体与包装载体共转染293T细胞，获得纯化浓缩病毒液，侵染SH-SY5Y细胞，采用绿色荧光示踪观察细胞的转染情况，利用qRT-PCR法检测GSK-3βmRNA，Western blot法检测GSK-3β、tau 蛋白及磷酸化tau 蛋白p-Tau(Ser 396)，p-Tau(Ser 404)，p-Tau(PHF-6)的表达水平。结果表明慢病毒介导的RNA干扰沉默GSK-3β基因在细胞水平可以降低tau蛋白磷酸化水平。应用APP/PS1双转基因AD小鼠，设慢病毒干扰组、空载体组、空白对照组，相同遗传背景的小鼠作为阴性对照组，双侧海马注射GSK-3β慢病毒载体，应用水迷宫实验进行小鼠学习记忆能力检测，HE染色观察海马区神经元形态结构变化，免疫组织化学方法检测海马区tau及磷酸化tau蛋白的表达，Western blot 方法检测海马区tau及磷酸化tau蛋白的表达。成功发现慢病毒干扰组转基因小鼠学习记忆能力较空载体及空白对照组明显改善。HE染色显示慢病毒组海马体形态与阴性对照组无明显差别。与空白对照组相比，tau 蛋白及磷酸化tau 蛋白水平均明显降低。. 成功构建了慢病毒介导的GSK-3β基因稳定沉默表达的SH-SY5Y细胞系，证明了慢病毒介导的RNA干扰沉默GSK-3β能够降低tau蛋白和磷酸化tau蛋白水平，改善阿尔茨海默病双转基因小鼠学习记忆能力。进一步阐明GSK-3β在AD发病机制中的作用，为探索AD基因治疗途径提供理论依据。. 申请发明专利一项（公开号：CN102703508A），核心期刊（修稿）两篇。