黑斑侧褶蛙遗传结构及其生境适应性研究

黑斑侧褶蛙（Pelophylax nigrolineatus）广布于我国的寒温带、中温带、暖温带、北亚热带、中亚热带和南亚热带等六个动物地理分布区。近年来，虽然黑斑侧褶蛙的种群进化历史已有明晰的阐述，但其精细的遗传结构和生境的适应性问题却迄今未见报道。鉴此，本项目（1）拟利用母系遗传的mtDNA控制区中性分子标记和双亲遗传的微卫星中性核分子标记分析黑斑侧褶蛙的遗传结构，并据此界定其具有独立遗传结构的"地理分化小种群"。（2）分离黑斑侧褶蛙适应性进化的MHC位点，并建立这一双亲遗传的功能性核分子标记系统。（3）利用（2）中建立的分子标记系统，分析（1）中界定的"地理分化小种群"的MHC适应性进化模式，并结合（1）中获得的遗传结构的相关参数，从分子生态学的角度揭示黑斑侧褶蛙的生境适应性这一科学问题。

黑斑蛙（Pelophylax nigrolineatus）是我国的广域分布种，也是一种正受到生存威胁并处于种群衰退期的非濒危蛙类。近年来，国内外有关学者对黑斑蛙的研究报道主要集中于线粒体标记确定黑斑蛙的分类学地位及冰川期种群的避难所分析。由于黑斑蛙迁移能力较弱，且具有两栖类特有环境敏感体质，加之近年逐渐加剧的捕杀力度，目前黑斑蛙的遗传格局，以及适应性进化景观遗传特征如何，却是分子生态学家日益感兴趣的话题。. 文献表明，动物精细遗传结构的检测，需要使用两套或两套以上的分子检测标记。否则，其检测结果，很可能会出现方向性的偏差。鉴此，本项目拟采用项目组自黑斑蛙的基因组中筛选获得的13个具有高度多态性的微卫星核标记并加之文献的mtDNA控制区标记，来阐明黑斑蛙的遗传结构。同时，由于主要组织相容性复合体MHC这一具有高度多态性的功能性基因家族标记，是迄今揭示动物生境适应性进化机制的首选分子标记，因此，本项目拟利用项目组已建立的分离I类和II类MHC基因位点的方法，分离黑斑蛙的I类和II类MHC基因位点，并在此基础上，通过建立相应的MHC分子标记系统来揭示黑斑侧褶蛙的生境适应性机制。. 本研究取得的主要结果如下：.(1) 基于cDNA序列分离和基因组步移技术，首次建立了黑斑蛙I类MHC经典座位的抗原呈递区外显子3的特异性分型技术；.(2) 基于通用引物扩增获取II类MHC的抗原呈递区外显子2，然后结合基因组步移技术获取侧翼内含子，首次建立了黑斑蛙II类MHC外显子2的特异性分型技术；.(3) 采用母系遗传标记线粒体D-loop，双亲遗传标记微卫星，病毒性抵抗标记I类MHC和细菌性抵抗标记II类MHC共同检测黑斑蛙的遗传变异水平，结果发现单倍型或等位基因的多样性水平分别是7.21（线粒体），7.42（微卫星），15.75（I类MHC），4.33（II类MHC），以I类MHC的变异水平最高，而以II类MHC的变异水平最低，两种中性比较遗传变异水平接近，处于中等水平；.(4) 中性标记的群体检测结果表明，线粒体和微卫星均一致性显示，中国大陆的黑斑蛙种群分为中原支系和东北支系两个大支，由此定义中原和东北两个管理单元； .(5) 适应性标记MHC-I和-II基因的群体检测结果表明，两种MHC标记未形成明显的聚类结果，说明平衡选择为黑斑蛙MHC的主要作用机制。