硬骨鱼类黄鳝卵巢早期分化发育及其分子机制分析

脊椎动物卵巢决定和分化机制目前仍不清楚。黄鳝是极具价值的经济鱼类，具有自然性逆转现象，性腺早期都为卵巢，为研究脊椎动物卵巢分化发育机制提供了良好材料。我们前期组织学观察发现黄鳝卵巢分化可能在孵化后10-20天。本项目拟进一步通过黄鳝早期性腺中生殖细胞减数分裂分子标记如Scp3表达状况，结合卵巢分化前后性腺组织学变化，确定黄鳝早期卵巢分化时间点；应用定量PCR和原位杂交等技术分析黄鳝卵巢分化前后性腺分化相关功能基因表达变化，包括卵巢分化相关功能基因如foxl2和wnt4等，以及精巢分化相关功能基因如dmrt1和amh等；应用激光捕获显微切割技术分离黄鳝卵巢分化前后的性腺组织，采用抑制性消减杂交方法筛选卵巢分化前后差异表达基因，寻找、分析和鉴定黄鳝卵巢分化发育相关的新功能基因。研究成果将有助于阐明黄鳝及其它脊椎动物卵巢分化的分子机制，同时将为黄鳝性别的人工控制和规模化繁育提供理论指导。

黄鳝幼鱼孵化后1天（1 dph），原始生殖细胞（PGCs）迁入生殖嵴，建立生殖腺原基，PGCs分布于生殖腺原基外侧，形成了两条生殖上皮雏形。7 dph黄鳝未分化生殖腺内出现4个卵巢腔，开始分化为卵巢。14 dph黄鳝卵巢中出现减数第一次分裂细线期卵母细胞，30 dph时发育为双线期卵母细胞。随着发育进行，两条生殖上皮间的结缔组织间隔消失，卵巢腔变为3个。至60 dph时，黄鳝卵巢组织结构模式与成鱼类似，含两个卵巢内腔和一个卵巢外腔，发育较好的卵母细胞通常靠近卵巢外腔。10月龄时，黄鳝卵巢青春期启动，进入次级生长期。1龄时，黄鳝卵巢中卵母细胞生发泡偏位或消失，达到成熟。. 黄鳝早期性腺分化过程中，6 dph时可检测到芳香化酶cyp19a1a 和雌激素受体 erb表达；8 dph时可检测到foxl2大量表达，dmrt1a和dmrt1b开始表达；33 dph时检测到 dmrt1d表达。cyp19a1a表达早于dmrt1可能与未分化性腺发育为卵巢相关。黄鳝卵巢发育成熟过程中，cyp19a1a、amh和amhrII表达水平变化与青春期启动密切相关。. 制备了黄鳝Vasa、Scp3、视黄酸合成酶（Aldh1a2）和分解酶（Cyp26b1）抗血清。Vasa免疫阳性信号验证了所观察到的原始生殖细胞；Scp3免疫阳性信号证实了黄鳝早期卵巢分化和减数分裂起始时间点分别为7 dph和14 dph；6~10 dph黄鳝性腺中检测到Aldh1a2免疫阳性信号，但无Cyp26b1免疫阳性信号，提示黄鳝早期性腺具有较高的视黄酸合成能力，可能与卵巢分化和减数分裂启动相关。. 克隆鉴定了黄鳝wnt4、rspo1、rspo2、rspo3和gdf9等卵巢分化发育相关基因。7 dph黄鳝性腺中检测到较强的wnt4免疫阳性信号，以及相对较弱的Rspo2和Rspo3免疫阳性信号，提示wnt4、Rspo2和Rspo3可能与黄鳝卵巢早期分化发育相关。. 比较转录组分析表明黄鳝早期性腺中卵巢类固醇生成、紧密连接、卵母细胞减数分裂、PI3K-Akt信号通路、PPAR信号通路、Jak-STAT信号通路等在6~20 dph发育过程中上调，提示它们与黄鳝早期性腺分化发育为卵巢密切相关。早期性腺转录组数据为进一步分析黄鳝卵巢分化发育机制提供了坚实的平台基础。