鳞翅目昆虫抗BtCry1Ac细胞与敏感细胞主要差异蛋白的基因克隆及功能分析

以已建立的抗苏云金芽孢杆菌Cry1Ac毒素的粉纹夜蛾离体细胞与其同源的敏感细胞为材料，在完成了对两种细胞的差异蛋白分析的基础上，进而选择在肽指纹图谱、配体杂交及定量蛋白质组分析中表现与抗性相关并且差异较大的蛋白点，采用RACE技术克隆抗性相关候选基因的全长cDNA，通过实时荧光定量PCR分析差异蛋白在不同抗性水平细胞中的表达量，探讨其表达量与抗性的关系，并用RNA干扰技术证实抗性相关候选基因的功能。旨在揭示昆虫细胞对Bt Cry1Ac毒素产生抗性的相关基因，综合蛋白质组学和功能基因研究的信息，从核酸、蛋白质两个层次对差异蛋白进行功能分析。研究结果可从细胞水平上丰富人们对昆虫抗Bt毒素分子机制的认识。

随着Bt制剂的大量使用和转Bt植物的种植面积不断扩大，昆虫对Bt商品制剂或转Bt基因植物的抗性受到高度关注。我们在完成抗BtCry1Ac细胞与敏感细胞的蛋白质组学研究之后，提出对差异蛋白进行鉴定，然后从核酸、蛋白质两层次对差异蛋白进行功能分析，这些研究对于综合理解抗性产生的分子机制非常有必要。.首先我们在已有工作基础上对拟抗性相关蛋白质点进行了比较分析，选择出差异显著的几个点进行了抗性相关蛋白质点质谱仪鉴定，根据SwissProt数据库、PANTHER数据库来对所鉴定的蛋白进行功能分类，鉴定到的主要的拟抗性相关蛋白可分为10种，包括细胞骨架蛋白，热激蛋白，细胞信号通路调控蛋白以及能量代谢中所涉及到的一些酶类等。它们分别涉及到蛋白代谢，糖代谢，核苷酸结合，氧化还原，信号转导，脂生物合成，分子伴侣，转运载体，以及部分功能未知蛋白。研究结果显示在细胞水平上，昆虫对Bt毒素的抗性机理可能涉及到一系列极为复杂的机制。通过文献参考和代谢通路分析（KEGG数据库），我们选择了3种不同功能的蛋白：FBA；GPDH和（RSU-1）。PCR扩增到FBA、GPDH 以及RSU-1三个抗性相关基因的保守区序列，通过RACE 对3种拟抗性基因的3′末端的扩增；通过RACE对3种拟抗性基因5'末端的扩增。我们共获取了GPDH、FBA和RSU-1的全长序列，嗣后对这三个抗性相关基因做了序列比对分析，并构建系统发育树。最后通过转染RSU-1dsRNA来降低抗性细胞中RSU-1蛋白的相对含量，检测到干扰后的抗性细胞Cry1Ac抗性水平显著下降，进一步证明RSU-1作为一种信号转导过程中的重要调节蛋白，可能与细胞Cry1Ac抗性相关。.本研究发掘昆了几个昆虫细胞对Bt Cry1Ac毒素产生抗性的相关基因，通过综合蛋白质组学和功能基因研究的研究信息，探讨了昆虫对Bt毒素产生的分子遗传学基础，从新的角度丰富人们对昆虫抗Bt毒素分子机制的认识。同时以本项目为依托，还系统研究了Bt毒素受体的协同作用，建立了一株棉铃虫中肠细胞系，该细胞系能表达多种Bt毒素受体，对毒素非常敏感，为继续深入研究抗性分子机制奠定了重要基础。