基于内质网磷酸化蛋白质组学差异分析的甲壳胺抑癌标志分子的发现

甲壳胺具有抗癌抑癌药理作用，但其作用的分子机制尚不清楚。最近的研究揭示内质网蛋白质的磷酸化修饰在肿瘤的变化机制中有重要的调控作用，本项目在前期证明甲壳胺能抑制S180荷瘤小鼠肿瘤生长的基础上，拟从蛋白质表达水平和磷酸化修饰水平两角度对甲壳胺的抑癌机制进行探索，寻找分子标志物。将小鼠模型分为对照组、对照给药组、肿瘤组和肿瘤给药组，建立荧光差异凝胶电泳（DIGE）与Pro-Q Diamond染色结合串联质谱的比较蛋白质组学方法，对各组肝脏内质网蛋白质及磷酸化蛋白质同时进行整体观测和定量分析，获得差异表达谱；并经磷酸化抗体检测、生物信息学分析等解析免疫过程中发生变化的2-3种关键蛋白分子，初步揭示甲壳胺对内质网蛋白质及其磷酸化修饰的调控规律，为深化了解甲壳胺的抗癌机制提供新的思路。

甲壳胺具有抗癌抑癌药理作用，但其作用的分子机制尚不清楚。本研究建立了两种分析方法，结合FACS等免疫技术，来探索甲壳胺抑瘤作用的机制、寻找其抑瘤作用的靶点。第一个方法是荧光差异凝胶电泳（DIGE）与Pro-Q Diamond 染色结合串联质谱的比较蛋白质组学方法。通过DIGE 实验与Pro-Q Diamond 分开运行，再通过DIGE 扫描图谱与Pro-Q Diamond 染色图谱进行匹配， 并将所有实验组的样品的等量混合物作为内标，不仅减少了系统误差，使实验结果更加真实地反映生物学问题，而且有利于凝胶点的精准的定量及统计分析。第二个方法是基于iTRAQ标记的shotgun策略，可以补充DIGE技术对疏水性蛋白质的信息缺失。此方法在实际样本中初步应用，共鉴定得到506种蛋白质，其中差异蛋白169个，免疫印迹试验验证了其中3个差异蛋白的表达差异。本项目还探索了甲壳胺对荷瘤小鼠肝脏免疫细胞功能的影响。流式细胞检测等实验发现，分布于外周血和肝脏中的淋巴细胞，CD3， CD4和CD8表达阳性的细胞显著增高，还可显著增高外周血和肝脏中IL-1和IL-6 和 TNF-α的表达等。研究结果还证明，甲壳胺可以显著增强患癌小鼠机体的免疫力。进一步实验制备出纳米级甲壳胺，并初步比较了其与普通甲壳胺对人结肠癌LoVo细胞的抑瘤作用差异。相比常规尺寸的甲壳胺，纳米级甲壳胺的体外抑瘤作用最好、且有一定的剂量依赖性，非水溶性和低分子量甲壳胺对LoVo细胞有中度抑制作用，O-羧甲基甲壳胺对对LoVo细胞几乎没有抑瘤作用。口服甲壳胺或纳米级甲壳胺可能是一个很好的癌症辅助疗法。部分相关工作已在国际期刊International Immunopharmacology、国内核心期刊《热带医学杂志》、《生物技术通讯》等期刊上发表，并获得国家发明专利一项，国家实用新型专利一项。