TMEM166基因在氧、糖剥夺培养神经细胞和基因改造小鼠脑缺血模型中的整合生物学研究

On the bases of the finding on new gene of TMEM166 by Peking University Center for Human Disease Genomics,and our new publication that TMEM166 regelating the autophagy and apoptosis following the focal ischemia in rat(Experimental Neurology 2012[Epub ahead of print].The mechanism of TMEM166 on the regulation in the central neuroanl system following brain ischemia and hypoxia is the subject of this research program. We will study in the fild of cells,tissues,organs,neural system and in vivo,which including three parts:(1)To study the mechanism of TMEM166 on the autophagy and apoptosis by translating TMEM166 gene over-expression and dysfunction in the culture of hippcampus neurons in vitro;(2)To study the molecular signaling pathway of TMEM166 regulating the autohagy and apoptosis by using different inhibitors of autohagy and apoptosis in the culture of hippcampus neurons in vitro;(3) To study the mechanism and effection of TMEM166 in vivo by using TMEM166 gene transgenic mouse and gene knock out mouse by genetic manipulation suffered middle cerebral artery occlusion, to explore the possible strategy for clinical therapy in cerebral strock by inhibiting the TMEM166 signaling pathway of autophagy and apoptosis.

TMEM166为北京大学人类疾病基因研究中心通过高通量功能筛选获得的新基因，最近我们的实验证明TMEM166调控大鼠局部脑缺血后神经细胞的自噬和凋亡（Experimental Neurology，2012）。由此我们凝练出TMEM166如何调控缺血和缺氧性神经细胞死亡的作用机理这一科学问题。本研究项目在分子、细胞、组织、器官、系统和机体多层次上开展整合生物学研究，研究内容有三个部分：（1）通过将TMEM166基因转染培养海马神经细胞的过表达和去功能化，研究TMEM166调节神经细胞自噬和凋亡的机理；（2）在氧、糖剥夺培养的海马神经细胞分别采用自噬和凋亡的多种特异性抑制剂和基因干扰，研究TMEM166基因调节缺氧诱导自噬和凋亡的分子传导通道；（3）分别采用TMEM166转基因和基因敲除小鼠的局部脑缺血模型，深入研究TMEM166对缺血性脑损伤的作用机制，探讨新的临床治疗策略。

Transmembrane protein 166（TMEM166）是北京大学人类疾病基因研究中心采用反向生物学策略，对人类功能未知基因的大批量克隆、高通量功能筛选出的一个明显下调内参活性同时诱导细胞死亡的新基因。过表达TMEM166可以抑制HeLa细胞的克隆形成能力，进一步研究发现TMEM166最终能够引起自噬性细胞死亡。本项目在此基础上我们提出有关TMEM166如何诱导自噬的新科学问题作为本项目的研究内容。本项目采用TMEM166基因转染培养的海马神经细胞；另采用氧、糖剥离培养的大鼠海马细胞分别以凋亡和自噬抑制剂封闭不同的分子转导通道，分析其下游的信号传导途径；另采用PDCD5基因敲除小鼠的局部脑缺血模型上，从分子、细胞、组织、器官、系统到机体的多层次上开展的整合性的研究工作。深入探讨TMEM166在缺血性神经细胞自噬与凋亡性死亡的调节机制，评估TMEM166抑制剂在脑保护方面的作用前景，不仅有助于阐明脑血管疾病和某些神经系统性病变的病理机制，并完成在局部脑缺血实验动物在体研究的转化。 研究结果揭示（1）首次揭示了在缺血性脑损伤的病理变化过程中自噬性细胞死亡是脑损伤的重要损伤途径，在本文之前大多学者认为脑缺血后会出现脑保护性细胞细胞自噬。本文结果显示TMEM166蛋白在局部缺血脑区出现的高表达与自噬特异表达蛋白Beclin-1和LC3一致，荧光双标记共聚焦显微镜观察证明TMEM166与Beclin-1在MCAO缺血24小时的大脑皮质梗死半影区的神经细胞共存，证明TMEM166参与了缺血性脑损伤的自噬性细胞死亡。（2）应用TMEM166的siRNA作为干预因素可明显减小脑梗死的面积；减少神经细胞的死亡数目；降低实验动物的死亡率；缓解脑缺血性损伤后的神经功能障碍；减轻脑缺血性损伤后对血脑屏障的破坏和因此产生的脑积水；（3）本项目采用北京大学人类疾病基因研究中心发现的另一个自噬相关基因 Programmed Cell Death 5程序性细胞死亡因子5（PDCD5）以前称为TFAR19（tf-1-cell凋亡相关基因19）的基因敲除小鼠的实验研究得到同样结果，进一步证明缺血性脑损伤存在着自噬性细胞死亡通道；有目的的去阻断自噬性细胞死亡通道可为脑缺血的治疗提供精准医疗提供新的思路。