利用CRISPR/Cas9系统修复人葡萄膜黑色素瘤关键致癌性GNA11基因突变

Uveal melanoma is the most common intraocular malignancy in adults. Metastasis will occur in about half of uveal melanoma patients and there has been no effective therapy for metastasis. GNAQ/11 mutations are the most important finding in uveal melanoma, which can lead to the activation of downstream pathway. In our previous work, we found that there were GNAQ/11 mutations in Chinese uveal melanoma. Because of the molecular nature of GNAQ/11, direct inhibition to mutant GNAQ/11 proteins has not been possible to date. CRISPR/Cas9 system can do in site gene modification, and is simple and efficient. Therefore, we hypothesize that GNA11 mutation in uveal melanoma may be corrected by CRISPR/Cas9 system. We plan to introduce targeted plasmid into GNA11 mutated uveal melanoma cell, and then detect the correction efficiency and evaluate the effect on tumor cells by cell function experiments and animal experiments. This study will provide experimental theoretical basis for uveal melanoma molecular targeted therapy.

葡萄膜黑色素瘤（UM）是成人最常见的原发于眼球内的恶性肿瘤，约一半患者会发生血行转移，对于已发生转移的患者目前尚无有效治疗措施，因此UM患者亟需全身治疗方法。GNAQ/11突变是迄今发现的UM中最重要的致癌性基因突变，该失活性突变导致G蛋白亚单位组成性激活，进而导致下游通路激活以及促进UM的恶性进程。我们前期工作也发现中国人UM中存在GNAQ/11突变。鉴于GNAQ/11突变在分子水平的隐性特征，目前尚无法实现对该突变的直接抑制。CRISPR/Cas9系统能够对细胞进行定点基因修复，并且具有简单、高效的优点。因此我们设想：利用CRISPR/Cas9系统可能实现对UM细胞GNA11基因突变的修复。我们拟在GNA11突变的UM细胞中导入特异性的靶向质粒，检测其修复效率，并通过细胞功能学实验以及动物体内实验评价基因修复对肿瘤细胞的影响。本研究将为开辟新的UM分子靶向治疗策略提供实验理论依据。

葡萄膜黑色素瘤（UM）是成人最常见的原发于眼球内的恶性肿瘤，约一半患者会发生血行转移，对于已发生转移的患者目前尚无有效治疗措施，因此UM患者亟需全身治疗方法。GNAQ/11突变是迄今发现的UM中最重要的致癌性基因突变，该失活性突变导致G蛋白亚单位组成性激活，进而导致下游通路激活以及促进UM的恶性进程。本研究尝试利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，敲除人葡萄膜黑色素瘤细胞系的GNA11基因，探索改变GNA11基因的编辑方法。本研究设计了针对GNA11基因的特异性引物，并将引物链接到pCAS9/gRNA1载体，将阳性载体转染人葡萄膜黑色素瘤细胞系OCM-1和MUM-2，利用无限稀释的方法获得转染后的单克隆细胞株，利用流式细胞技术筛选转染阳性的细胞株，提取不同细胞株的基因组，通过测序的方法进一步筛选出发生GNA11基因切割的细胞株。我们获得2株GNA11基因敲除的细胞株，该细胞株不表达GNA11基因，但在后续的实验中，我们发现该细胞株无法稳定地传代，尚不能够完成细胞功能实验。本研究的结论是：利用CRISPR/Cas9系统可以编辑敲除人葡萄膜黑色素瘤细胞的GNA11基因，但编辑效率较低，尚不能获得稳定传代的细胞株。