海参脑苷脂的结构解析及其对脑神经元的保护作用研究

The research is on three edible sea cucumbers, Apostichopus japonicus, Acaudina molpadioides, and Thelenota ananas, to prepare sea cucumber cerebrosides by high-speed counter-current chromatography (HSCCC), high throughput analyze the composition and structure of sea cucumber cerebrosides by liquid chromatography?electrospray ionization?Quadrupole?Time-of-Flight mass spectrometry (LC-ESI-Q-TOF). By means of culturing hippocampus neurons in vitro and adding β-amyloid (Aβ), to observe the effect of sea cucumber cerebrosides in different structure on nerve cell aging improvement, galactocerebroside from bovine brain as control group. On this basis, use senescence accelerated mouse/prone 8 (SAMP8) model and animal behavior analytical system, to evaluate the effect of cerebrosides in different structure on learning and memory improvement of animals. Compare Aβ distribution and content in brain by pathological analysis. Subsequent, by liquid chromatography?triple quadrupole tandem mass spectrometry (LC-QQQ), determined the variation of content and molecular species of glucocerebroside and galactocerebroside in "membrance fraction" of mouse frontal cortex before and after eating sea cucumber cerebrosides. Then determine the activity of BACE1 in "membrance fraction" by enzyme-linked fluorescence immunoassay, which is the key enzyme leading to the formation of the neurotoxic Aβ. According to these results, investigate relationship between structure of sea cucumber cerebrosides and structure and content of cerebrosides in brain, as well as brain function, for the purpose of understanding the mechanism and structure activity relationship of anti brain functional regression activity of sea cucumber cerebrosides, which plays a vital role in the discovery of new marine raw materials and supplement of novel sea cucumber nutritional efficacy.

以仿刺参、海地瓜和梅花参三种主要食用海参为对象，利用HSCCC法高效制备海参脑苷脂，通过LC-ESI-Q-TOF技术高通量分析其单体的组成和结构。以牛脑脑苷脂为对照，采用海马神经元，通过添加Aβ，比较不同结构特征海参脑苷脂改善神经细胞老化的作用差异。在此基础上，以快速老化痴呆小鼠为模型，利用小动物行为分析系统，评价食用不同结构特征的海参脑苷脂对动物学习记忆能力的改善作用。通过病理学分析，比较脑组织中Aβ的沉积分布和含量差异。利用LC-QQQ技术检测摄食海参脑苷脂前后小鼠大脑皮质和海马的胞膜组分中脑苷脂的含量及分子种组成变化，采用酶联荧光免疫法分析Aβ生成的关键酶（BACE1）的酶活性变化。据此结果，进一步分析海参脑苷脂的结构特征与脑内脑苷脂的含量和结构变化、脑功能之间的联系，明确海参脑苷脂的神经保护作用机制和构效关系。研究结果对于海洋新原料来源的发现和海参新型营养功效的补充具有重要意义。

海参脑苷脂（SCC）是由单糖与神经酰胺相连构成的一类鞘糖脂类化合物，主要为葡萄糖脑苷脂（GlcCer）。目前脑苷脂的分子种组成和结构鉴定是该研究领域的难点，海参脑苷脂保护脑功能的作用机制尚未阐明。项目的主要研究内容是利用 HSCCC 法高效制备海参脑苷脂，采用液质联用技术高通量分析其分子种组成和结构，通过细胞实验筛选出活性高且结构特征差异显著海参脑苷脂，采用小动物行为分析、分子生物学、鞘脂组学等方法学进行系统评价，阐明海参脑苷脂神经保护作用机制和构效关系。取得的成果有：创新性将高速逆流色谱技术应用于海参脑苷脂及其系列物为的高效分离制备，采用LC-ESI-Q-TOF技术，建立了一种子离子扫描结合中性丢失筛选，准确、高通量筛选分析脑苷脂分子种组成和结构的新方法。通过体内和体外实验系统性的研究了海参脑苷脂在神经保护和预防阿尔兹海默症（AD）方面的作用。通过体外实验首次证明SCC具有促进神经细胞突触重塑的作用，明确其作用机制依赖于促进突触重塑相关蛋白突触素和GAP-43的表达，进而研究了三种不同脑苷脂系列物（羟基个数不同）的作用差异，首次发现活性最佳的为哺乳动物中罕见的t-长链碱和羟基脂肪酸相连的脑苷脂系列物。建立了三种AD小鼠脑组织中鞘脂分析的NPLC-MS/MS、RPLC-MS/MS、HILIC-MS/MS方法，分别准确分析了脑组织中四种主要鞘脂的含量、各鞘脂分子种变化、葡萄糖型脑苷脂变化的情况，证明动物脑组织中脑苷脂的含量和结构变化与脑功能之间的关系，为疾病模型的鞘脂代谢研究提供了可靠的技术平台。探究了AD小鼠鞘脂代谢的紊乱状况，并发现其脑苷脂、神经酰胺及硫苷脂的含量，神经酰胺（d18:1-C18:0）、硫苷脂（d18:1-C24:1）分子种含量，以及脑苷脂、硫苷脂的羟基化水平、葡萄糖脑苷脂含量较正常组均显著变化，而SCC对AD鞘脂的代谢紊乱具有一定的改善作用，阐明了摄食海参脑苷脂对动物神经保护、脑功能维持的影响及其作用机制。本研究填补了国内外海参脑苷脂研究领域的多项空白，为海参营养和食疗价值提供科学依据，为海参产业健康发展提供理论支撑，研究结果对于海洋新原料来源的发现和海参新型营养构效的补充具有重要意义。