circErbB4-miR-29a-AT2R调控轴在AT1R自身抗体诱导血管平滑肌细胞骨架重构中的机制研究

The cytoskeleton remodeling of vascular smooth muscle cells is the basis for regulating vascular tension. Our previous study found that angiotensin II (Ang II) type 1 receptor autoantibody (AT1-AA) in promoting vascular smooth muscle cytoskeleton remodeling and upregulating the expression of angiotensin II type 2 receptor (AT2R), but the mechanism of AT2R expression change in AT1-AA induced cytoskeleton remodeling is unclear. This study by overexpression / knockdown of AT2R, staining to observe the changes of cytoskeleton with phalloidin, to clear the function of AT2R in AT1-AA induced cytoskeleton remodeling; according to the microarray results suggest that using gene overexpression or knockdown technology, to explore the molecular mechanism of AT1-AA promoting the expression of circErbB4; Using bioinformatics analysis , Oligo-pull down, luciferase reporter assay and in situ hybridization confirmed circErbB4 works as miRNA sponges, by combined with miR-29a, relieving the repression of AT2R expression. Finally, the molecular mechanism of circErbB4-miR-29a-AT2R regulation axis in AT1-AA induced cytoskeleton remodeling in vascular smooth muscle cells is elucidated.

血管平滑肌细胞骨架重构是调节血管张力的基础。我们前期研究发现，血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）1型受体自身抗体（AT1-AA）在促进血管平滑肌细胞骨架重构的同时，上调了Ang Ⅱ 2型受体（AT2R）的表达，但AT2R表达改变在AT1-AA诱导细胞骨架重构的机制不清。本研究拟通过过表达/敲低AT2R，用鬼笔环肽染色观察细胞骨架的变化，明确AT2R在AT1-AA诱导细胞骨架重构中的作用；根据芯片结果提示，运用基因过表达或敲低技术，探讨AT1-AA促进circErbB4表达的分子机制；利用生物信息学分析、Oligo-pull down，荧光素酶报告基因分析、原位杂交等技术，从ceRNA机制上证实circErbB4通过海绵作用吸附miR-29a，解除其对AT2R表达的阻抑,从而上调AT2R表达。最终阐明circErbB4-miR-29a-AT2R调控轴在AT1-AA诱导平滑肌细胞骨架重构的分子机制。

血管平滑肌细胞骨架重构是引起细胞迁移和血管重塑的重要基础。我们前期研究发现，血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）1型受体自身抗体（AT1-AA）在促进细胞骨架重构同时上调了Ang Ⅱ 2型受体（AT2R）蛋白质表达，但AT2R蛋白质表达的改变在AT1-AA诱导细胞骨架重构的作用机制不清。本研究首先通过鬼笔环肽染色和 transwell 等实验发现，在小鼠血管平滑肌细胞中，AT1-AA 通过促进细胞骨架重构引起细胞迁移。过表达或者敲低AT2R后，促进或者抑制AT1-AA诱导的骨架重构和细胞迁移。Western blot和Real-time PCR 等结果显示，AT1-AA上调AT2R mRNA和蛋白质水平。通过细胞转染、双荧光素酶报告基因分析和染色质免疫共沉淀（ChIP）等分析发现，干扰素调节因子-1（IRF-1）和锌指转录因子 Krüppel 样因子-5（Klf-5）在AT2R基因启动子上协同促进其转录。除此之外，我们还发现非编码RNA (ncRNA) 在AT2R表达调控过程中也发挥着重要作用。其中，通过芯片分析和软件预测发现环状 RNA（circRNA）和微小 RNA（miRNA）通过竞争性内源 RNA（ceRNA）机制参与AT2R 的转录后调控。通过 Real-time PCR、桑格测序、原位杂交和双荧光素酶报告基因分析等实验明确 circErbB4-miR-29a-5p 介导的AT2R转录后调控。以上结果说明，IRF-1-Klf-5-AT2R和circErbB4-miR-29a-5p-AT2R共同参与 AT1-AA对AT2R基因的表达调控；AT2R通过骨架重构加速细胞迁移，最终导致血管重塑。本研究表明，AT1-AA通过与Ang II不同的分子机制促进了血管平滑肌细胞迁移和骨架重构最终导致血管重塑，并且发现了AT2R基因新的调控机制，为AT1-AA相关血管疾病的治疗中提供新的思路。