毛竹黄酮碳苷合成代谢途径中C-糖基化及其C-糖基转移酶的研究

Plant C-glycosidic flavonoids own well solubility in water, stability of structure and biological activity. Study on the anabolism pathway and the key enzyme is necessary to gain a great deal of C-glycosidic flavonoids by metabolic engineering.At present, the report about C-glycosylation substrate of plant C-glycosidic flavonoids anabolism pathway is different, and the struture characteristics of the enzyme is not very clear. To confirm substrate of the C-glycosylation pathway,to find the C-glycosyltransferase and to research on the structure characteristics of the enzyme in the C-glycosidic flavonoids anabolism pathway of Moso bamboo. Using high resolution mass spectrometer (Q-TOF), qualitative and quantitative analysis on different period metabolite of C-glycosidic flavonoids anabolism pathway in Moso bamboo leaves is performed, basing on the data analysis, find the key time and substrate of C-glycosylation,and to confirm the time and substrate by experimentation; Basing on the confirmed time and substrate, to design the method to determine C-glycosyltransferase activity, the dynamic change rule of C-glycosyltransferase activity is determined;Using Q-TOF, basing the bioinformatics method, and analysis of enzymatic struture characteristics is performed;To explore crystallorgaphic structure of the C-glycosyltransferase. To provide scientific basis for metabolic engineering of C-glycosidic flavonoids.

植物黄酮碳苷具有良好水溶性、结构稳定性和生物活性，应用价值广泛。研究植物黄酮碳苷合成代谢途径及关键酶是通过代谢工程大量获得黄酮碳苷的必要前提。目前，关于植物黄酮碳苷合成代谢途径中C-糖基化底物有不同报道，对C-糖基转移酶结构认识还不清楚。为了对毛竹黄酮碳苷合成代谢途径中的C-糖基化底物进行确证，发现C-糖基转移酶，并研究其结构特点，本项目利用高分辨质谱仪（Q-TOF），定性定量分析一个生长周期毛竹叶黄酮碳苷合成代谢途径相关代谢物组变化动态，基于代谢组学统计分析，找到C-糖基化底物和时间，并进行试验确证；基于确证的C-糖基化底物和时间，设计酶活检测方法，研究C-糖基转移酶活性动态变化规律；利用Q-TOF，基于生物信息学，分析C-糖基转移酶结构；探索C-糖基转移酶晶体结构。为下一步通过代谢工程大量获得黄酮碳苷提供科学理论依据

植物黄酮碳苷拥有良好的水溶性、结构稳定性和多种多样的生物活性，具有广泛的应用价值。代谢工程是大量获得黄酮碳苷的重要途径，而研究黄酮碳苷合成代谢途径及关键酶是通过代谢工程大量获得黄酮碳苷的必要前提。目前，关于植物黄酮碳苷合成代谢途径中C-糖基化底物有不同报道，对C-糖基转移酶（C-glycosyltransferase,CGT）结构认识还不清楚。.本项目主要研究内容和结果有：.（1）毛竹叶片主要黄酮成分定性定量研究：从毛竹叶中分离鉴定异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素、木犀草苷6种黄酮化合物；建立了4种黄酮碳苷含量液相色谱分析方法。.（2）质谱分析蛋白质裂解的特征离子的研究：以模式肽段VQGESNDLK为对象，优化了氨甲酰化方法；对模式肽段VQGESNDLK和BSA酶解肽段进行氨甲酰化修饰，研究其b和y系列离子特点；对模式肽段VQGESNDLK和BSA酶解肽段进行氨甲酰化和胍基化双修饰，研究b和y系列离子特点；分析了模式肽段VQGESNDLR、蔗糖磷酸化酶酶解肽段的亚胺及其相关离子，对130个肽段的亚胺及其相关离子在不同碰撞能量下出现的频次进行了统计。结果表明：亚胺及其相关离子在合适的碰撞能范围内都可以作为对应氨基酸残基存在的标志。.（3）毛竹叶黄酮碳苷C-糖基化途径及其C-糖基转移酶的研究：建立了毛竹叶黄酮碳苷C-糖基转移酶（CGT）反应体系HPLC检测方法；毛竹叶黄酮碳苷C-糖基化途径的研究，毛竹叶黄酮碳苷C-糖基化的主要途径是CGT催化木犀草素和UDP-葡萄糖直接合成异荭草苷；毛竹叶黄酮碳苷CGT的质谱及结构分析。.（4）毛竹中黄酮-C-糖基转移酶（CGT）基因的克隆和功能鉴定：基于毛竹基因组数据，应用生物信息学分析方法，从毛竹中获得三条黄酮-糖基转移酶基因；构建了5种原核表达载体，在两种原核表达体系中成功表达；构建了两个真核表达载体，即pPIC9K-PeCGT1和pPIC9K-PeCGT2。其中，PeCGT1成功表达，获得具有活性的目的蛋白。.本项目对毛竹黄酮碳苷合成代谢途径中C-糖基化底物进行确证，发现C-糖基转移酶，基于生物信息学对其结构进行分析，找到调控C-糖基转移酶的基因，对通过代谢工程大量获得黄酮碳苷具有重要意义。