不同时间点鞘内注射甲基强的松龙治疗大鼠急性脊髓损伤的蛋白组学实验研究

急性脊髓损伤（ASCI）是一种严重的神经系统创伤。大剂量甲基强的松龙（MP)静脉注射治疗ASCI是目前临床唯一有效的药物，但必须是在8小时内使用，否则其副作用会远远大于治疗效果。如果能突破其大量MP的副作用以及时间窗的限制，对于提高临床治疗效果具有重要意义。本课题通过Allen's法制作大鼠急性脊髓损伤模型后，分别于0h，3h，6h，8h，12h鞘内注射MP，于治疗24h后无菌提取脑脊液和损伤段的脊髓组织，用二维液相色谱对脑脊液和损伤段的脊髓组织进行蛋白分离，采用计算机分析技术，对图谱上的蛋白质点进行定位定量、比较、差异点寻找；蛋白质点进行酶切、纯化；采用SELDI-TOF-MS技术测定肽质量指纹图；用LCQ-ESI-MS技术测定肽序列，找出明显变化的差异蛋白，分别进行蛋白质数据库检索，以进一步行差异蛋白鉴定和功能分析，为在分子水平上治疗ASCI寻找新的思路及提供实验室理论依据。

目的：本研究通过临床观察发现问题、建立动物模型、改变常规静脉给药途径为鞘内注射，采用蛋白印迹法、免疫组织化学染色法、适时定量RT-PCR和原位末端标记法等方法，观察大鼠急性脊髓损伤(acute spinal cord injury, ASCI)后不同时间点鞘内注射甲基强的松龙(Methylprednisolone,MP)对ASCI后继发性神经细胞凋亡的抑制作用。方法：利用差异蛋白组学等方法为基础的分子生物学研究，首先采用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)，继而运用了先进的iTRAQ技术对大鼠ASCI后不同时间点给予鞘内注射MP治疗后脑脊液、脊髓标本分析，从中发现损伤段脊髓组织和脑脊液中有意义的差异蛋白表达，并分析了其中的差异蛋白-热休克蛋白（heat shock protein，Hsp）在ASCI代谢通路中起到的潜在作用，为当今难以解决的ASCI的研究奠定了研究基础。结果：ASCI后，改变传统的大剂量静脉给药，采用MP鞘内注射，使用较小剂量的MP治疗ASCI有一定疗效，避免了大剂量使用激素以后的副作用。鞘内注射MP对ASCI后继发性神经细胞凋亡的抑制作用是通过抑制白介素-1（Interleukin-1，IL-1β），继而抑制caspase-3基因表达，并减轻ASCI后神经细胞凋亡的发生。在大鼠ASCI后的脊髓组织中共鉴定到了2432个蛋白，差异蛋白220个；脑脊液中共鉴定到843个蛋白、差异蛋白107个。其中相关神经再生的差异蛋白12个（上调的有7个，下调的有5个），相关炎症因子的差异蛋白12个。实验发现相关炎症因子Hsp(Hsp90ab1、Hspa4和Hspe1)在ASCI后的继发性损伤中的代谢通路中占据重要作用，对神经细胞的修复有促进作用。鞘内注射MP治疗ASCI的早期作用是通过抑制炎症因子的表达而发挥作用的。结论：我们认为检测到的“相关神经再生的差异蛋白和相关炎症因子的差异蛋白”可作为ASCI后的生物学标记或临床管理监测指标，对ASCI损伤后的继发性损伤、靶向治疗及疗效评估的提供强有力的证据。