我国海水甲壳类中寄生性甲藻（Hematodinium)的种群遗传结构及其分子系统分类地位的研究

The parasitic dinoflagellates, Hematodinium spp., are emerging globally and infecting the growing number of marine crustaceans including various commercially important species. Recently, Hematodinium was found in southeast coast of China and had caused epidemic diseases in several cultured crustaceans, such as Portunus trituberculatus, Scylla serrata etc. Previous research mainly focused on field survey and pathogen identification. Little, however, is known about the genetics of this protist pathogen in China, which is necessarily needed for understanding this type of organism and for adopting appropriate management to prevent and control the diseases. Therefore, we propose to study the genetic variations among the Hematodinium populations from different hosts and geographic locations in China using series of molecular markers. Research on the genetic systematic status of the China strains will also be conducted through phylogenetic analysis of Hematodinium spp. around the world. In addition, new molecular markers specific to the Chinese strains (or species) could be developed based on the results from the genetic analysis. This research will not only facilitate the research on the fundamental aspects of Hematodinium, but also provide efficient molecular tools for studies on the other closely-related parasitic dinoflagellates. At the same time, it could help prevent and control the disease spreading.

Hematodinium是一类广泛寄生于海洋甲壳类动物中的寄生性甲藻，其在世界范围的流行已经严重影响了经济甲壳类的可持续性渔业生产。近年来，Hematodinium在我国近海养殖的几种重要经济甲壳动物中流行，并造成了重大经济损失。我国对Hematodinium的研究目前仅限于流行性调查、病原确定等前期阶段，缺乏该类甲藻的分子生物学等方面的基础知识。本研究将对我国的Hematodinium种群进行系统的分子测序和遗传分析，以分析不同群体间的遗传结构，以及与国外几个代表种的遗传差异和亲缘关系，从而探讨这类寄生性甲藻在我国蔓延扩散的规律以及系统进化地位。在此基础上，进一步设计和开发具有种特异性的分子标记，为进行系统的生物学、生态学研究提供可靠的分子手段。本研究的开展将填补国内Hematodinium相关研究的空白，推动寄生性甲藻的基础研究，同时为预防和控制该病害的扩散提供理论指导。

本研究通过对蛋白编码基因Hsp90、Cob、Cox1和核糖体基因的测序分析，研究了中国沿海感染养殖甲壳类的寄生性甲藻（Hematodinium，血卵涡鞭虫）群体的基因型以及遗传结构。研究显示，中国沿海存在两个基因型，H. perezi II和新种H. sp. 2。由于缺少其它样本，无法确定这一新种的宿主范围和流行率等。通过对ITS序列的分析发现，中国沿海存在8个不同的ITS单倍型（Haplotype），它们之间在于ITS1区域有三个单碱基突变（SNPs）和一个单碱基插入（indel）位点， ITS2区域有三个微卫星（microsatellite）位点不同。这些单倍型在三个地理群体中的出现频率明显不同。每个地理群体的单倍型组成呈双峰型。浙江群体的两个常见单倍型分别与相邻两群体（山东和广东群体）共有；而地理距离较远的山东和广东群体的常见单倍型完全不同。 进一步的分子遗传方差分析（AMOVA）显示， 中国沿海的三个地理群体间存在显著的遗传差异， 且来自于同一区域但不同年份的群体间没有明显的遗传差异，说明，不同地理群体间的遗传差异并非由于某年的取样的随机性造成的。另外，通过对多个样本的克隆测序，探讨了单个个体内rDNA基因的序列差异对群体间遗传差异研究的影响。结果显示，除了上述的单个宿主可能感染多个Hematodinium种之外，同一个宿主个体内也有发现两个ITS单倍型，这可能是病原的多次感染（multiple infection）造成的，这种多次感染的发生率约为14.3%。同时，克隆后测序的方法，使所得的序列产生了大量的由单碱基突变（单子，Singleton）造成的单一单倍型（unique haplotype）。这些单子大多是在PCR过程中，由于所用Taq酶的错配、并经过克隆过程放大造成的 ，所测的拷贝数越多，产生的单子越多。经估算，每10000bp序列，可以产生约6.4个单子。因此正确区分这种个体内rDNA序列的差异，对于我们准确估算个体间及群体间的遗传差异非常重要。综上所述，本研究检测到中国沿海养殖甲壳类中存在两种血卵涡鞭虫。H. perezi II在中国沿海的流行范围较广，且不同地理群体间存在一定的遗传差异。在今后的工作中，将关注新种的流行范围和宿主范围等。本研究发现的8个H. perezi II单倍型，可以为后续关于传播途径、生活史等方面研究提供有效的分子工具。