槲皮素调控AMPK/mTOR通路影响急性髓系白血病细胞线粒体功能诱导凋亡与自噬的机制研究

Tumorigenesis is regulated by apoptosis and autophagy closely. Adenosine monophosphate activated protein kinase(AMPK) is a key cellular sensor for energy metabolism. Abnormal energy metabolism may induce cell apoptosis and autophagy. Our preliminary study had proved that quercetin had anti-leukemia effect by inducing acute myeloid leukemia (AML) cells apoptosis and autophagy. What was its specific mechanism? Our further study found that the expressions of AMPK in AML primary cells and HL-60 cells were lower than peripheral blood mononuclear cells in healthy human and quercetin could activate AMPK in HL-60 cells. Specific inhibitor Compound C can inhibit the quercetin-induced phosphorylation of AMPK and autophagy. We infered that cell apoptosis and autophagy had a common signaling pathway and AMPK might be the central molecule. Quercetin might generate its anti-leukemia effect by affecting cell energy metabolism and modulate AMPK/mTOR signal pathway, and then inducing mitochondrial apoptosis and cell autophagy. This project was designed to explore the mechanism of quercetin-induced leukemia cell programmed death by observing the effects of quercetin on cell energy metabolism and mitochondrial function, and to find the signaling pathways of quercetin-induced cell apoptosis and autophagy by cell and animal experiment. Furthermore, we attempt to seek novel drug targets in the treatment of AML, and provide the theoretical foundation for the development of drugs with low toxicity.

凋亡和自噬与肿瘤发展密切相关，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是调控细胞能量代谢的关键分子。能量代谢异常可诱发凋亡及自噬。前期文章证实中药活性成分槲皮素可诱导急性髓系白血病(AML)细胞株发生凋亡及自噬产生抗AML效应。但具体的机制是什么？前期研究发现AML原代细胞及HL-60细胞中p-AMPK表达低于健康人外周血单个核细胞；槲皮素可激活AMPK继而抑制mTOR；AMPK活性受抑后槲皮素对凋亡和自噬的调控减弱。我们推测：凋亡和自噬存在共同信号通路，AMPK可能是其中心分子；槲皮素可能影响线粒体功能，通过AMPK/mTOR通路诱导细胞发生凋亡及自噬，产生抗白血病作用。本项目拟通过观察槲皮素对细胞能量代谢及线粒体功能的影响，探讨槲皮素诱导白血病细胞程序性死亡的机制；从细胞水平和动物体内实验两个方面阐明槲皮素诱导凋亡与自噬的信号通路。从而从而为AML治疗寻求新靶点，为中国传统低毒性药物开提供理论依据。

急性髓系白血病(AML)是成人最常见的造血祖细胞恶性肿瘤之一。 槲皮素作为一种几乎无毒的植物来源药物，近年来因其抗癌作用而受到广泛关注。 为探讨槲皮素抗白血病的机制及槲皮素诱导白血病细胞自噬和凋亡的信号通路， 我们检测了槲皮素对白血病细胞的作用，发现槲皮素能抑制白血病细胞的增殖并减少白血病细胞集落的形成，槲皮素诱导的细胞凋亡和自噬性死亡存在协同作用，共同发挥抗白血病作用。 p-AMPK蛋白在AML原代细胞、HL-60细胞、KG-1和THP-1细胞中的表达量均低于外周血单个细胞，而mTOR在各组白血病细胞中的表达均高于外周血单个核细胞。与槲皮素共孵育后，白血病细胞内p-AMPK表达增加，p-mTOR表达减少，且呈剂量依赖性。 Compound C是AMPK磷酸化抑制剂，可抑制槲皮素诱导的AMPK磷酸化。当采用 Compound C抑制AMPK的活化后，槲皮素对p-mTOR的抑制作用减弱，槲皮素诱导HL-60细胞的自噬和凋亡减弱。AMPK/mTOR是槲皮素诱导细胞凋亡和自噬的重要信号通路。采用siRNA对 CaMKK β的表达进行沉默后，可以抑制槲皮素诱导的AMPK磷酸化；其后续的抑制mTOR磷酸化的作用减弱。 CaMKK β表达的缺失影响槲皮素诱导的HL-60细胞自噬。本研究提示CaMKK β是槲皮素激活AMPK/mTOR通路的上游信号分子。本研究通过皮下成瘤构建小鼠白血病模型，体内实验证实槲皮素在体内可诱导细胞凋亡和自噬，并发挥抗白血病作用。对小鼠白细胞、血红蛋白、血小板、谷丙转氨酶、肌酐等检测后证实，槲皮素在小鼠体内具有低骨髓毒性、低肝毒性和低肾毒性的特点。对瘤体细胞中AMPK、mTOR的蛋白水平和磷酸化水平进行检测证实，槲皮素在体内能够激活AMPK，抑制mTOR的激活。 本研究通过体内外数据共同表明槲皮素通过抑制白血病细胞的增殖，诱导细胞凋亡和自噬来发挥其抗白血病作用。 槲皮素通过调节AMPK/mTOR的磷酸化，从而发挥调控自噬和凋亡的作用。 CaMKK β是AMPK/ mTOR信号通路潜在的上游分子，槲皮素通过其诱导白血病细胞凋亡和自噬。