骨桥蛋白调控实验性青光眼视网膜小胶质细胞的激活及其机制研究

Glaucoma is a type of irreversible blinding eye disease characterized by a combination of multiple factors that eventually lead to the progressive loss of retinal ganglion cells. The activation of microglia is involved in the pathogenesis of glaucomatous optic neuropathy. Osteopontin (OPN) is an active mediator in the process of neurodegeneration, which can participate in the pathogenesis of neurodegenerative diseases of the central nervous system by regulating the activation and function of microglia. However, it is not yet fully elucidated whether OPN could regulate the activation of microglial cells and what it’s the regulatory mechanism during the glaucomatous optic neuropathy. Our preliminary study found that OPN expression increased in chronic ocular hypertensive retina, and its expression was closely associated with the distribution of activated microglia. After blocking OPN, the activated microglia decreased significantly. Therefore, we will use rat model in vivo with chronic ocular hypertension and retinal microglial cells culture in vitro under the pressure condition to study the effect of OPN on the retinal microglia activation and function in experimental glaucoma condition. At the same time, we will further explore the important signaling pathway of OPN for the regulation of microglia activation in experimental glaucoma condition. The expected results of this project will enrich the glaucomatous optic nerve damage mechanisms, and provide the experimental evidences for excavating the treatment method and target of neuroprotection.

青光眼是一类以多种因素共同作用最终导致视网膜神经节细胞进行性丢失为特征的不可逆性的致盲眼病，小胶质细胞的激活参与了青光眼视神经病变的病理损害过程。骨桥蛋白（OPN）是神经退行过程中的一种活性介质，其可通过调控小胶质细胞的激活和功能来参与中枢神经系统神经退行性疾病的发病过程，但其是否对青光眼视网膜小胶质细胞的激活具有调控作用及其调控机制如何目前尚未完全阐明。我们前期的研究发现慢性高眼压眼视网膜中OPN的表达增加，且其表达与激活的小胶质细胞的分布密切相关，阻断OPN后，激活的小胶质细胞明显减少。由此本项目将采用大鼠慢性高眼压模型的在体实验和小胶质细胞加压培养的体外实验，进一步研究OPN对实验性青光眼状态下视网膜小胶质细胞激活和功能的影响，同时探讨OPN对实验性青光眼状态下小胶质细胞激活调控作用的重要信号通路，丰富青光眼视神经病变的作用机制，为发掘青光眼的视神经保护方法和治疗靶点提供实验依据。

青光眼是一种视神经退行性病变，小胶质细胞的激活和炎症因子的释放与青光眼的发生发展密切相关，但其潜在关联和具体机制尚不清楚。本研究通过建立大鼠慢性高眼压（COH）模型，观察视网膜中OPN及其受体表达水平、小胶质细胞激活状态、炎症因子的分泌情况、视网膜神经节细胞（RGCs）丢失及视功能的变化情况。分离并在压力培养系统下培养原代小胶质细胞，以评估小胶质细胞分泌的OPN和炎症因子[肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）]在体外的表达情况。分别用OPN重组蛋白、OPN中和抗体（Anti-OPN）及OPN特异性小干扰RNA（SiR-OPN）在体内外模型中进行干预。采用免疫荧光、Western blot、qRT-PCR和CCK-8等方法检测OPN表达、小胶质细胞增殖、激活及炎症因子分泌情况。采用对应的通路抑制剂对JAK/STAT、NF-κB、ERK1/2和p38 MAPK等与小胶质细胞激活相关的信号通路进行筛查，以明确参与OPN调控视网膜小胶质细胞激活的信号通路。荧光金上丘逆行标记RGCs和闪光视觉诱发电位（flash visual evoked potentials, F-VEP）用于研究RGCs的存活及视功能损伤情况。主要研究结果显示：（1）COH造模导致RGCs丢失及视功能受损。（2）COH造模后视网膜中OPN、小胶质细胞标记物离子钙接头蛋白-1（Iba-1）和白细胞分化抗原11b（CD11b）以及小胶质细胞激活标记物白细胞分化抗原68（CD68）表达增加。（3）加压培养后，可观察到小胶质细胞的激活及OPN的表达增加。（4）OPN在体内外均可促进视网膜小胶质细胞的增殖和激活，导致小胶质细胞中TNF-α和IL-1β的分泌增加，IL-6的分泌减少。（5）降低OPN的表达（Anti-OPN干预、SiR-OPN转染）或阻断p38 MAPK信号通路（SB203580干预）可抑制小胶质细胞的增殖激活并扭转炎症因子的分泌趋势。（6）抑制OPN的作用或阻断p38 MAPK信号通路可延缓RGCs丢失并改善视功能。本课题的研究成果有望为多靶点的药物研发提供思路，为青光眼的临床治疗提供新的切入点。