结构修饰壳聚糖纳米EGCG对MCF-7肿瘤细胞的抑制作用和分子机制研究

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，且患病率呈增长趋势。当前的预防和治疗效果还不是很理想，因此还有待研究开发高效的乳腺癌预防和治疗药物。研究表明表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对多种人类肿瘤细胞株的生长有抑制作用，但其在体内对肿瘤组织的定向攻击弱，生物利用率低。本项目拟以MCF-7乳腺癌细胞为研究对象，壳聚糖（CS）为载体，EGCG为药物，叶酸（FA）和聚乙烯乙二醇（PEG）为修饰剂，借助AFM、CLSM 和FTIR等先进微结构分析技术制备EGCG-(FA+PEG)-CSNPS；采用酶标仪、流式细胞仪和鸡胚绒毛尿囊膜方法，研究其对MCF-7 细胞生长、周期和凋亡的影响，以及对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响；通过蛋白印迹法和反转录酶-聚合酶链锁反应，研究其对MCF-7 肿瘤细胞信号通路关键蛋白和mRNA 表达量的影响，为EGCG纳米粒子作为肿瘤治疗药物的深度开发提供理论依据。

EGCG是绿茶中提取分离的多酚类生物活性物质，且对多种癌症和其它慢性疾病均有化学预防作用。EGCG在体内对肿瘤组织的定向攻击弱，生物利用率低，，以及低效的给药系统都影响了EGCG功能的发挥。将EGCG封装在纳米粒子中可以提高EGCG的生物利用率, 体现剂量优势。因此，利用纳米技术来弥补EGCG存在的问题。. 本文以EGCG为药物模型，就提高其在MCF-7肿瘤细胞中的靶向性和缓释效果为目的，进行纳米EGCG药物粒子的制备工艺优化；从细胞水平研究纳米 EGCG粒子对MCF-7肿瘤细胞生长的影响，在前人研究基础上，考虑不同纳米载体对EGCG药物的影响和纳米EGCG修饰的抑制肿瘤效果，从而拟定出以CS为载体，用FA和PEG修饰制备高靶向性和高缓释效果的EGCG纳米粒子；并考察比较它们对MCF-7肿瘤细胞的毒性、抑制增殖、影响凋亡；并研究其对MCF-7细胞信号通路关键蛋白和mRNA表达量的影响。取得结果如下：. 一、通过结构化修饰获得了EGCG包封率达到了72.64%、粒径在150 nm ~ 300 nm的EGCG壳聚糖纳米粒子，通过FT-IR和1HNMR进一步表征证明EGCG-NPs修饰FA和PEG是成功的。. 二、利用激光共聚焦显微镜拍摄罗丹明B标记下的纳米粒子的靶向性。其中效果最好的是叶酸EGCG纳米粒子；有叶酸修饰的纳米粒子的靶向性高于未修饰粒子。在72h，纳米粒子的释放率为53.4%，体外释放试验的研究证明了EGCG-NPs在控释给药有很大的潜力。. 三、纳米粒子在实验浓度范围内均未出现细胞毒性；纳米粒子在400 μg/mL时，各纳米粒子对MCF-7的抑制效果最为明显，抑制效果最好的为叶酸、PEG共同修饰的纳米粒子；纳米粒子能很好地促进MCF-7细胞凋亡和抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成。. 四、EGCG及其两种纳米粒子对PI3K-Akt信号通路的作用，能显著下调p-PDK1、p-Akt、CyclinD1和Bcl-2蛋白的表达，但对总Akt蛋白的表达无明显影响；并能提高PTEN、p21、Bax蛋白的表达，达到抑制乳腺癌的效果。RT-PCR检测EGCG及其纳米粒子对MCF-7 PI3K-Akt信号通路下游基因的调控作用，结果显示下调一些关键基因：p-PDK1、p-Akt、CyclinD1和Bcl-2，且调控作用随着样品浓度的加大而逐步增加