普洱茶微生物代谢产物的生物合成及其活性研究

采用筛选出来的三种微生物，以儿茶素类化合物为底物，对普洱茶素Ⅰ-Ⅳ的生物合成机理进行系统研究，阐明其生物合成途径、调控基因和相关酶，为普洱茶的发酵和该类化合物的大规模制备奠定理论基础。对三种微生物进行进一步筛选，筛选出高产菌株，在此基础上，进一步优化液体培养条件，并进行放大试验；建立普洱茶素Ⅰ-Ⅳ的分离、制备方法，获得足够量的化合物，为大规模制备提供技术保障。对普洱茶素Ⅰ-Ⅳ进行系统的降血脂、降血糖、抗氧化等生物活性和作用机理研究，发现活性先导化合物，阐明其作用机理，为创新药物的发现奠定基础，同时也阐明普洱茶后发酵的科学理论，促进普洱茶产业的发展。具有重要的学术价值和应用前景。

普洱茶为著名的后发酵茶，课题组前期对其化学成分进行系统研究，从中分离得到4个微生物代谢产物，命名为普洱茶素。为明确普洱茶素是如何产生进而阐明普洱茶的后发酵机理，本课题采用自然分离的方法，从普洱熟茶中分离得到一株能生物转化普洱茶素的菌株，经形态学和分子鉴定，为黑曲霉Aspergillus niger，命名为M03。接着，以菌株M03模拟渥堆后发酵普洱茶，以LC-MS为导向从中分离得到20个新普洱茶素类化合物。而后，采用LC-MS建立基于多级质谱中提取诊断离子的普洱茶素类化合物的快速检识，对市售普洱生茶和熟茶所含普洱茶素类成分进行分析。从中鉴定了70个普洱茶素类化合物，其中共有普洱茶素有46个，24个仅存在于熟茶中。采用LC-MS方法对39批普洱茶中普洱茶素I-VIII进行准确定量，26个其它普洱茶素类化合物进行了半定量分析。采用降血脂和抗老年痴呆小鼠模型对普洱茶素的生物活性进行了评价，发现普洱素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均显著降低糖脂代谢紊乱的ApoE-/-小鼠血糖水平，普洱素Ⅰ和Ⅱ还能显著降低小鼠的血浆总胆固醇和甘油三酯水平，其降血糖药效可能源于其对α糖苷酶活性的抑制。SAMP8早老痴呆模型筛选结果表明普洱茶素IV对SAMP8小鼠具脑神经元保护作用。分子作用机制研究表明，PIV同时具备抗氧化和抑制A-β42蛋白代谢途径的作用。.通过单因素考察、Plackett-Burman设计、最陡爬坡实验及Box-Behnke设计响应面法优化菌株M03生物转化普洱茶素的培养基组成及发酵条件，优化条件下普洱茶素的转化率为0.284%，提高近6倍。之后，通过静息细胞培养的方法，对普洱茶素生物合成途径进行研究，并在此基础上，对参与生物合成反应的黑曲霉L-氨基酸氧化酶进行克隆表达，纯化获得重组L-氨基酸氧化酶并对其酶学性质和酶促反应动力学进行研究。考察4种曲霉属真菌发酵对普洱茶香气成分的影响及普洱茶中甲氧基苯类化合物的含量测定，发现曲霉属真菌对普洱茶香气品质的形成具有举足轻重的作用，并且甲氧基苯类化合物含量随普洱茶年份的增加而增加。.研究结果阐明了普洱茶的功效成分及后发酵机理，为普洱茶的应用和开发提供了重要参考。