禽白血病病毒新亚群受体的解析及其介导的分子感染机制

New subgroup K avian leukosis virus (ALV-K) was emerging in the past recent years. ALV-K could be isolated from tumor cases in some Chinese indigenous chicken lines, but more ALV-Ks were found in apparently healthy Chinese local chicken lines. The emerging ALV-K poses new challenge to the key ongoing national disease eradication program--avian leukosis eradication program for breeders, especially the mechanism of ALV-K entry and infection remains unknown. With methods of cellular biology, molecular virology and bioinformatics, the project aim to study and identify the specific cell membrane receptor protein, to locate the position of receptor cell in the chicken genome, to examine the distribution and activity of receptor gene in the different tissues and different Chinese indigenous chicken line, and to further explore the molecular infection mechanism mediated by the receptor. The aim of the project is to reveal the ALV-K specific receptor, the gene mapping and distribution and receptor mediated infection mechanism. The innovative study will provide scientific evidences to clarify the oncogenesis of ALV-K infection and to formulate control and eradication program for ALV-K.

近年来，新发现的K亚群禽白血病病毒（ALV-K）的报道逐渐增多，该群病毒既可分离于有肿瘤病变表现的一些地方品种鸡种群，也见于临床表现健康的另一些地方品种鸡种群。新发现的ALV-K对于当前我国正在推进的动物疫病净化重点工程---种鸡场禽白血病净化提出新的挑战，尤其是大家都不了解ALV-K的侵入和感染机制。本项目拟通过细胞生物学、分子病毒学和生物信息学等技术和方法分析和鉴定能特异性识别ALV-K的细胞表面受体蛋白，确定受体蛋白基因在鸡基因组中的位置，再分析受体蛋白基因在不同地方鸡种和不同组织中的分布特点和活性，并进一步研究受体蛋白在介导ALV-K 侵入宿主细胞中的分子机制。本项目立意于探索和阐明ALV-K感染宿主过程中病毒与宿主互作基础的受体蛋白解析、基因定位和组织分布及受体介导的感染分子机制，其研究结果不仅有很强的创新性，也为进一步阐明ALV-K的感染致瘤机制和制定防控净化措施提供科学依据。

近年来新发现的K亚群禽白血病病毒（ALV-K）在我国黄羽肉种鸡群中的分离率呈逐年升高的趋势，已对进行中的种鸡场禽白血病净化形成新的挑战，但ALV-K感染机制未明。本项目拟在建立ALV-K检测方法和限制性细胞系的基础上，解析出能与ALV-K受体互作的关键氨基酸位点，并揭示ALV-K感染后的主要胞内信号传导通路。本项目建立了可鉴别ALV-K的永生细胞系DF-1/K，同时建立了3种快速检测ALV-K核酸的分子方法和1种检测ALV-K抗体的ELISA方法；对6株ALV-K分离株进行了全基因组序列测定和分析，对鸡的致病性试验表明ALV-K分离株可引起低于30%病毒血症，在感染后125天内未观察致肿瘤现象；应用免疫共沉淀和蛋白质谱分析鉴定出能与ALV-K gp85蛋白互作5个目标蛋白，其中包括ALV-A受体Tva（CD320）。通过连续的、逐段替换ALV-K GDFX0602与ALV-E ev-1 gp85蛋白，构建了一系列嵌合可溶性gp85蛋白和具有完全复制能力的禽反转录病毒载体(RCASBP)和为骨架的一系列重组病毒，经免疫共沉淀分析、流式细胞术分析GFP阳性细胞比例和病毒滴度测定，确定了hr1中的aa194-198，aa206-216和hr1与hr2之间的aa251-256，hr2中的aa269-280在gp85蛋白与Tva的结合中发挥了关键作用，而单氨基酸突变G196A和R198H几乎完全终止了gp85与Tva的结合及ALV-K的感染能力。ALV-K体外感染和体内感染都激活ERK/MAPK信号通路，并且可以引起ERK/MAPK信号通路中的原癌基因Ras和c-Myc上调，且其上调过程是依赖于ERK/MAPK信号通路活化完成的，ERK/MAPK信号通路的活化影响ALV-K体外复制。本项目为进一步阐明ALV-K侵入宿主细胞机制及抗病毒靶点筛选提供了思路。