基于晶体结构解析禾谷镰孢菌β微管蛋白与苯并咪唑类杀菌剂互作分子机制

Fusarium Head Blight (FHB) of cereals caused by Fusarium graminearum is one of the most destructive fungal diseases worldwide. Despite the ineffectiveness of some benzimidazole fungicides against Fusarium, they are currently the most widely used treatment for plant infections. β tubulin is the target of benzimidazole fungicides. The effect of the benzimidazole fungicides is significantly reduced for serious resistance produced by β2 tubulin mutant and β1 tubulin over expression. However, it is unknown how β tubulin and carbendazim participate in the interactions between them. On the basis of previous studies, we will determine the crystal structures of tubulin proteins of F. graminearum，their mutants and the related complexes. Meanwhile, we propose to analyse the interaction between β tubulin and carbendazim by a combination of different biochemical, biophysical and genetic techniques. This study will establish an important basis for us to further understand the molecular bases of the molecular mechanism of resistance to the benzimidazole fungicides. The results also provide structural basis for the design and screen of environmentally friendly chemicals with high efficient that that specifically target pathogen-unique protein.

禾谷镰孢菌是引起小麦赤霉病的主要病原菌。苯并咪唑类杀菌剂是用于防治该病害的主要杀菌剂之一，其靶标为β微管蛋白。β微管蛋白氨基酸的突变和诱导过量表达使病原菌产生严重抗药性，致使该类杀菌剂防效显著下降。但禾谷镰孢菌β微管蛋白与苯并咪唑类杀菌剂互作的分子机制并不清楚。本研究拟采用蛋白质晶体学、生物物理学和分子遗传学等技术开展禾谷镰孢菌微管蛋白及其突变型的蛋白晶体结构和生物学功能研究，内容包括：β微管蛋白与苯并咪唑类杀菌剂相互作用分析，微管蛋白及其与杀菌剂复合物的晶体结构解析。该研究将为深入阐释禾谷镰孢菌对苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性的分子机制奠定结构基础，同时也为开展基于病菌特异靶标蛋白的新型环保高效杀菌剂的设计、改造奠定结构基础。

禾谷镰孢菌是引起小麦赤霉病的主要病原菌。苯并咪唑类杀菌剂是用于防治该病害的主要杀菌剂，其靶标为β微管蛋白。禾谷镰孢菌β微管蛋白与苯并咪唑类杀菌剂互作的分子机制并不清楚。本研究拟采用分子遗传学等技术开展禾谷镰孢菌微管蛋白及其突变型的蛋白结构和生物学功能研究。通过同源建模的方法获得了禾谷镰孢菌β2微管蛋白的三维结构，并在此基础上将β2微管蛋白与4种苯并咪唑类杀菌剂多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵进行分子对接。分子对接结果显示β2微管蛋白第198 位苯丙氨酸和第236位缬氨酸与4种苯并咪唑类杀菌剂直接互作形成氢键，第50、134、165、167、198、200、236、237、239、240、250、253、257、314位氨基酸形成药剂结合口袋。通过比较β2微管蛋白与4种苯并咪唑类杀菌剂结合自由能发现，与其他3种杀菌剂相比，β2微管蛋白与多菌灵的结合自由能最小（-5.72 kcal/mol），说明其与多菌灵互作亲和力更强。采用菌丝生长速率法测定了禾谷镰孢菌对4种苯并咪唑类杀菌剂的EC50值，禾谷镰孢菌对多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵的 EC50 值分别为0.772、0.862、1.088、13.266mg/L，该结果表明禾谷镰孢菌对多菌灵的敏感性强于其他3种杀菌剂，与分子对接结果相吻合。为探究β2第138位丝氨酸是否与抗药性相关，通过基因定点突变技术将禾谷镰孢菌β2第138位氨基酸由丝氨酸（Ser）突变为丙氨酸（Ala），并获得遗传转化子，测定了野生型PH-1、敲除体、互补体及突变体对多菌灵、苯菌灵及噻菌灵的敏感性。它们对多菌灵的EC50值分别为0.4314 、0.1418 、0.3186 、0.2079mg/L，与禾谷镰孢菌野生型PH-1及回补体相比，突变体及β2敲除体EC50值变小，对多菌灵更敏感。它们对苯菌灵的EC50值分别为0.9323 、0.2193 、0.9732、0.3315mg/L，与禾谷镰孢菌野生型PH-1及回补体相比，突变体及β2敲除体EC50值变小，对苯菌灵更敏感。. 该研究将会为深入地阐释禾谷镰孢菌微管蛋白对苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性的分子机制，同时也会为开展基于病菌特异靶标蛋白的新型环保高效杀菌剂的设计奠定结构基础，进而对新型药物设计具有重要意义。