调控巨噬细胞极化的microRNA分子鉴定及其在CVB3诱导的急性病毒性心肌炎中的作用

Viral myocarditis (VMC) is a kind of clinical common infectious disease of cardiovascular system. Accumulating documents indicated that cardiac injury was associated with heart-infiltrating macrophages and differentially polarizated macrophages played a role in VMC. However, mechanisms that underlie macrophage polarization remain largely undefined. MicroRNAs are short inhibitory non-coding RNAs that block the translation and play important biological roles in cell development, differentiation and immune regulation. Our preliminary experiments found that differentially expressed microRNA profiles existed in polarizated macrophages in vitro, indicating that individual microRNA may play a role in macrophage polarization. The differential expression of selected miRNAs was validated by real-time qRT-PCR: miR-155-5p was upregulated and miR-125-5p was downregulated in heart infiltrated macrophages from CVB3 infected male and female mice, respectively. In the present study, we aim to screen individual microRNAs associated with macrophage polarization by comparative analysis of microRNAs profiles in polarized macrophages. Besides, we will explore the possible mechanisms of individual microRNAs in regulating macrophage polarization and its potential role in VMC. Meanwhile, we will identify mRNA targets binding to individual microRNA. Our study will help to further understand the mechanism of VMC and provide a novel therapeutic strategy in treating inflammatory cardiac disease.

研究发现，病毒性心肌炎时心肌细胞损伤与巨噬细胞浸润有关，不同极化状态的巨噬细胞在病毒性心肌炎发病过程中发挥重要作用。然而，调控巨噬细胞极化的机制尚不清楚。申请人前期发现，体外极化的巨噬细胞miRNA表达谱存在差异；进一步研究发现，CVB3感染的雌、雄小鼠心脏浸润巨噬细胞（M2/M1）分别高表达miR-125b和miR-155，提示上述两个miRNAs参与了M1/M2极化过程,然而其机制不明。本研究中，我们拟比较分析体内外不同极化状态的巨噬细胞miRNA表达谱的变化，从而筛选出调控巨噬细胞极化的个体miRNA；通过生物信息学预测和报告载体实验鉴定其靶基因；通过阻断或过表达等方法，体内外观察个体miRNA调节靶基因表达和功能对巨噬细胞极化的影响及其在病毒性心肌炎发病过程中的作用，从而为病毒性心肌炎的发病机制研究和生物学防治提供新的理论基础和实验依据。

研究发现，病毒性心肌炎时心肌细胞损伤与巨噬细胞浸润有关，不同极化状态的巨噬细胞在病毒性心肌炎发病过程中发挥重要作用。然而，调控巨噬细胞极化的机制尚不清楚。申请人前期发现，体外极化的巨噬细胞miRNA表达谱存在差异；进一步研究发现，CVB3感染的雌、雄小鼠心脏浸润巨噬细胞（M2/M1）分别高表达miR-125b和miR-155，提示上述两个miRNAs参与了M1/M2极化过程,然而其机制不明。本研究中，我们拟比较分析体内外不同极化状态的巨噬细胞miRNA表达谱的变化，从而筛选出调控巨噬细胞极化的个体miRNA；通过生物信息学预测和报告载体实验鉴定其靶基因；通过阻断或过表达等方法，体内外观察个体miRNA调节靶基因表达和功能对巨噬细胞极化的影响及其在病毒性心肌炎发病过程中的作用。. 在本研究中，我们利用miRNA芯片技术筛选出109个M1/M2中差异表达的miRNA分子，选取表达差异最明显的miR-155和miR-125b进一步研究。通过对比miR-155-/-基因敲除小鼠和野生型C57BL/6小鼠发现，miR-155基因敲除后，M1标志物如TNF-α、IL-12、NOS2、MHCII和CD16/32的表达明显降低，反之，M2标志物如Arg-1， FIZZ1、YM-1、CD206和CD301的表达显著升高，M2极化的关键转录因子STAT6的磷酸化水平升高。在CVB3诱导的小鼠心肌炎模型研究中发现，miR-155基因敲除后，IFN-γ的释放减少而IL-4，IL-13的表达量增加；脾脏中CD4+ T细胞增殖能力减弱，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的活化降低；病理结果显示，miR-155基因沉默后，心肌受损减弱，小鼠死亡率降低。提示，沉默miR-155基因诱导的M2极化明显改善心肌炎小鼠的心脏功能。进一步研究miR-125b-5p发现，miR-125b-5p高表达于M2，过表达miR-125b-5p促进M2极化而抑制M1极化；当敲低miR-125b-5p时，M2型标志物基因表达水平下降，M1型标志物基因表达水平上升，并且NF-κB信号通路中主要蛋白IKK、p-65的磷酸化水平升高。生物信息学预测结合双荧光素酶报告实验鉴定出miR-125b-5p靶基因为TRAF6。提示miR-125b-5p靶向TRAF6影响NF-κB信号通路活化水平促进M2型巨噬细胞极化。