建立低毒、高亮、细胞特异、环路结构与功能兼顾的HSV示踪体系

Structure and function elucidation of complex neural circuits is fundamental for understanding brain mechanisms. Neurotropic viral transsynaptic tracers have become increasingly powerful tools to dissect neuronal circuits. The properties of specific anterograde transsynaptic spreading, large cargo-capacity and broad host range make HSV1 H129 strain a unique, extremely valuable candidate for mapping output neuronal circuits, but only very limited H129 tracers are available up to now because of their common shortcomings, such as high toxicity, low sensitivity, non-specific labeling, etc. To address these problems, this project will take advantages of merits of HSV as vector, to integrate 1) low-toxic HSV engineering; 2) synergic amplification of transgene expression; 3) Cre/Flp inducible expression elements; 4) introducing various fluorescent reporter and functional probe genes; 5) TK-dependent transsynaptic order-controllable strategy, to develop novel HSV tracing system that is low-toxic, hypersensitive, cell type-specific and suitable for simultaneous studies of structure and function of neuronal circuits. Such novel HSV tracing systems will be applied to transgenic mice expressing Cre in targeted populations of neurons to analyze the structures and functions of the VTA and micturition center associated output neural circuits. Through this project, a novel technology platform for simultaneous studies of structure and function of output neural circuits using the novel HSV tracing systems will be established.

神经环路结构和功能解析是理解大脑工作机制的基础。嗜神经病毒跨突触示踪已发展成为相关研究的重要方法。HSV1 H129株具有特异顺行跨突触传播、荷载容量大、感染宿主范围广等优势，但目前实用的H129工具病毒很少、而且普遍存在毒性大、灵敏度低、起始感染细胞不特异等缺陷。针对这些问题，本项目将充分利用HSV的优势，系统整合1）HSV低毒株的优化；2）基因表达的级联增强；3）Cre或Flp调控系统控制基因的条件性表达；4）多样荧光和功能探针的重组携载；5）跨突触级数的TK控制等策略，构建低毒、高亮、起始细胞特异、环路结构和功能解析兼顾的HSV示踪新系统。作为方法验证，以Cre转基因小鼠为对象，利用HSV新系统揭示VTA全脑输出网络以及小鼠膀胱上行回路的结构和功能特性。通过项目实施将建立一套可对特定脑区输出网络进行结构和功能同步解析的神经环路研究新工具体系。

神经环路结构和功能解析是理解大脑工作机制的基础。嗜神经病毒跨突触示踪已发展成为神经环路解析的重要方法。HSV1 H129株具有特异顺行跨突触、荷载容量大、宿主范围广等优势，但目前实用的H129工具病毒很少、且普遍存在毒性大、灵敏度低、起始感染细胞不特异等缺陷。针对这些问题，本项目集成一系列新策略开发低毒、高灵敏和细胞类型特异的新型HSV示踪病毒系统。.利用类似特洛伊木马的策略，我们构建了一种高亮的HSV/AAV嵌合体重组病毒（H8），通过HSV病毒和AAV复制系统的协同作用，外源基因被有效复制和扩增实现增强表达。H8可用于快速有效的顺行跨多突触追踪，无需额外的免疫染色。HSV/AAV嵌合可作为基于HSV的示踪病毒工具或基因递送载体的通用增强表达策略。.为了评估顺向示踪工具H129是否存在逆行标记性质，我们构建了TK和ICP34.5双缺失的减毒H306病毒，其在神经元中复制缺陷。体内外实验发现H306可通过轴突末端吸收感染上游神经细胞，无论是3天或10天的示踪结果均表现出明显的逆标特性，提示具有复制能力的H129顺向跨多突触追踪结果可能是一种混合网络。因此，当分析H129顺向追踪结果时应考虑逆标干扰。该工作首次深入验证了顺向HSV示踪剂具有明显的逆标特性，受到领域内广泛关注和引用。同时基于减毒株ltH129，我们构建了系列携载表达神经元活动操纵和监测探针的低毒HSV病毒工具，用于结构和功能环路兼顾解析。.为了开发严谨顺向的H129示踪剂，基于重靶向策略，我们构建了病毒糖蛋白gD携带抗Her2单链抗体的重靶向H129，在单链抗体介导下病毒仅靶向感染表达Her2受体的靶细胞。利用AAV辅助病毒补偿表达Her2和野生型gD蛋白，重靶向HSV能顺向跨单突触追踪特定脑区或特定类型神经元的直接投射区域，提供了一种严谨、实用的顺行跨单突触工具，该系统是对神经环路示踪技术的一个重要发展。.总之，通过该项目实施我们开发了一系列低毒、超敏、细胞特异、适于结构和功能环路兼顾解析的HSV示踪工具体系，丰富和发展了当前的神经环路示踪技术和工具病毒库。.