多能性转录因子和KDMs的相互关系及在重编程过程中的作用

转录因子介导的诱导型多能性干细胞（iPS细胞）的产生，是重编程在技术上的一个重要突破，而iPS细胞产生的周期长、效率低，解决这一问题需要理解重编程过程的机制。重编程过程伴随着染色质结构的重建，组蛋白的甲基化与去甲基化在染色质重建过程中起着重要作用。KDMs是组蛋白赖氨酸残基的去甲基化酶，与染色质结构的重建密切相关。还有文献报道，一些KDMs与胚胎干细胞（ES细胞）的自我更新、多能性的维持和分化相关，且Nanog, Oct4与转录抑制复合体形成一个共同复合体，其中就包括HDACs、LSD1等。本课题致力研究多能性转录因子和KDMs的相互关系及在重编程过程中的作用。首先，找出Nanog, Sox2和Oct4与哪些KDMs相互作用，然后揭示它们相互之间的作用机制和对下游基因的调控，最后探索这种相互作用在细胞重编程过程中的作用和功能。

研究者将四个转录因子Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc转入成纤维细胞可以生成诱导多能干细胞（iPS细胞），在这个过程中，细胞的染色质修饰模式发生了重大变化。DNA 甲基化和组蛋白的修饰共同调控染色质的结构和基因的活性。LSD1是最早被发现的去甲基化酶，它是细胞核中的胺氧化酶的类似物，通过依赖于FAD的氧化反应参与组蛋白的去甲基化。在体内LSD1通过结合转录复合体CoREST、CtBP、NuRD抑制转录。LSD1调控着早期胚胎发育、ES细胞分化等过程。重编程过程伴随着染色质结构的改变，一种可能的机制是组蛋白修饰酶和转录因子共同作用参与该过程的调控，而LSD1作为组蛋白的去甲基化酶可能会在重编程过程中发挥功能。为了探索LSD1在iPS细胞形成过程中的作用，首先比较了LSD1蛋白在MEFs和ES细胞中的表达量，结果表明LSD1蛋白在ES细胞中的表达量高于MEFs中。由于LSD1在ES细胞中的表达量相对MEFs高，所以想知道过表达LSD1对iPS细胞的生成是否有影响，于是在重编程体系中过表达LSD1，发现对iPS细胞的形成效率没有影响。同时，课题设计并构建了抑制LSD1表达的短发夹(shRNA)质粒，分别以四因子和四因子与shRNA两种病毒组合方式对细胞进行重编程实验，结果发现LSD1基因被抑制后，重编程效率与对照相比显著提高1倍左右。同时，在实验中加入不同浓度的单胺氧化酶抑制剂tranylcypromine，发现低浓度的tranylcypromine能够增加两倍左右的iPS细胞诱导效率，而高浓度的tranylcypromine能够抑制iPS细胞的诱导效率。接着，用LSD1抗体和IgG对照分别对R1细胞裂解液进行免疫沉淀，再分别用Oct4和Nanog抗体检测免疫沉淀后的裂解液，实验结果表明LSD1蛋白和Oct4、Nanog蛋白有直接的相互作用，说明LSD1通过和Oct4/Nanog相互作用调控iPS细胞的形成。随后发现，只需要在重编程的早期加入LSD1抑制剂便可以增加iPS的诱导效率，这可能是由于当外源性转录因子在细胞内表达后，发生一系列重要的表观遗传学变化，而LSD1作为NuRD复合体的一员可能起到一个平衡的作用，这一点需要进一步的探索。本项目的研究揭示了多能性转录因子通过结合LSD1在重编程过程中发挥重要作用。