基于宏基因组学对不可培养瘤胃甲烷菌作用靶点的分析研究

甲烷是引起全球气候变化的重要温室气体，全球17%的甲烷由反刍动物瘤胃产生。瘤胃甲烷减排可降低饲料能量损失，减缓温室效应，其必要前提是获得瘤胃产甲烷古细菌的遗传多样性。瘤胃甲烷菌多数不能培养，利用宏基因组学分析可掌握其基因组信息，通过与已知甲烷菌比对分析可确定共有基因，获得抑制瘤胃甲烷菌的分子靶点。本项目通过分离获得不同营养型甲烷菌的基因文库，同时获得不同抑制剂添加下甲烷菌的基因文库，对二者进行分子生物学分析操作，获得代表性重要瘤胃未培养甲烷菌的基因序列，在与已知甲烷菌比对分析的基础上，确定针对瘤胃甲烷菌的共有基因（抑制靶点）；提出饲粮途径降低甲烷产量和改善反刍动物生产力的策略，解明其微生物学基础和分子生物学机理；提升对瘤胃微生物生态学的了解，尤其是掌握甲烷菌与瘤胃其他主导细菌之间的相互关系，为我国的甲烷减排提供理论和实践依据。

本项目建立并分析了泌乳高峰期奶牛瘤胃壁、瘤胃食糜及瘤胃液古生菌16S rRNA基因文库，发现甲烷短杆菌属是泌乳高峰期瘤胃内存在的主要古生菌，广泛分布于瘤胃壁、瘤胃食糜及瘤胃液中。热裸单胞菌属为瘤胃液和瘤胃壁特有，甲烷球形菌属为瘤胃食糜特有，在属层面上从瘤胃液和瘤胃壁上各获得8株未分类古生菌。对自山羊瘤胃的真菌分离培养液中甲烷菌进行16S rDNA测序，序列及系统进化分析表明，真菌培养液中存在尚未分离培养的瘤胃甲烷菌，提示了两者的共生关系。通过抑制甲烷菌的生长探索甲烷菌存在与否情况下细菌的多样性变化，发现甲烷菌被抑制后，氢分压显著影响培养体系的菌群多样性。基于以上试验，我们分别研究了富马酸、植物精油、茶皂素、无患子皂甙4种添加剂对瘤胃甲烷菌及其他微生物的影响。在精粗比30:70的日粮情况下，添加延胡索酸二钠（30g/d）湖羊瘤胃内甲烷短杆菌1Y和未培养甲烷球形菌属减少。体外添加500 mg/L精油混合物或200mg/L活性单体混合物后，甲烷菌数量较对照组均显著降低，再组合添加10 mmol/L富马酸一钠时，甲烷菌数量最低；精油或活性单体混合物添加均大大降低了原虫数量，降幅均大于85%；真菌和两种纤维降解菌同样受到显著抑制，降幅也达80%以上。在体动物试验结果发现，添加精油混合物与富马酸一钠，甲烷菌、真菌和溶纤维丁酸弧菌数量没有变化（P>0.05），但显著抑制了瘤胃原虫和产琥珀酸丝状杆菌（P﹤0.05）；低量（0.5g/d）和高量（1g/d）活性单体混合物与富马酸钠添加时，对真菌和黄色瘤胃球菌的影响不显著（P>0.05），但显著抑制了甲烷菌、原虫和两种纤维降解菌（P﹤0.05）。分别对具虫、驱虫的湖羊进行添加和不添加茶皂素两种处理，结果显示，茶皂素可以有效抑杀原虫，添加茶皂素和驱虫均可有效抑制瘤胃甲烷的排放，茶皂素的甲烷抑制效果（10.6%）和驱除原虫（12.7%）相当。体外添加无患子皂甙显著降低甲烷产量，极显著降低产琥珀酸丝状杆菌的数量（P<0.01），显著降低原虫数量（P<0.05），显著提高溶纤维丁酸弧菌的数量（P<0.05）。本项目通过研究不同抑制剂添加下甲烷菌及相关重要纤维降解微生物群落结构的变化，提升了对甲烷减排过程中瘤胃微生物生态学的了解，提出了降低甲烷产量的饲粮途径，尤其是掌握甲烷菌与瘤胃其他主导微生物之间的相互关系，为我国的甲烷减排提供理论和实践依据。