高羊茅铅富集关键基因的发掘与功能解析

Lead (Pb) is one of the most toxic heavy metals.Excessive Pb in soil detrimentally affects plant, animals and even human beings. Tall fescue is a common turf and forage grass grown in China, which was relatively tolerant to heavy metals including Pb, and was identified as potential phytoextraction species because of its high biomass yield under elevated Pb levels and its ability to translocate high amount of Pb from roots to shoots.However, little information exists about the molecular mechanisms of Pb accumulation by tall fescue.The objectives of this study were i) to explore the key genes related to Pb accumulation in tall fescue,based on RNA-seq technique, using a genotype which can accumulation more Pb as the experiment material; ii) to obtain the whole length of cDNA sequences of certain genes that might be invovled in Pb accumulation by using the RACE technique，and analyze the transcription profiles of these genes in tall fescue with different ability of accumulation of Pb; iii) to study the possible functions of the key genes in the Pb accumulation or translocation in tall fescue by using transgenic technology, and finally obtain the key genes related to Pb accumulation in tall fescue. This study will promote the understanding of the molecular mechanims responsible for Pb accumulation in tall fescue, and provide usful genes for Pb phytoextraction tall fescue breeding based on the transgenic technology, so as to facilitate the phytoremediation of heavy metal polluted soils.

铅是已知毒性最大的重金属污染物之一，土壤中过量的铅对动植物和人类都有极强的毒害作用。高羊茅是我国广泛应用的冷季型草坪草兼牧草，对重金属铅有较强的富集和转运能力，被认为是能够修复铅污染土壤的一种极具发展潜力的植物，但目前对高羊茅富集铅的分子机理方面的研究严重滞后。本项目以一种铅富集能力较强的高羊茅基因型'Spirit'为研究对象，在人工控制条件下，利用RNA-seq技术，发掘铅富集相关候选基因；进一步通过RACE技术获得高羊茅铅富集若干关键基因的全长cDNA序列,研究其在高羊茅中的时空表达模式；最后，采用转基因技术对关键基因的作用与功能进行分析验证，最终获得在高羊茅铅富集过程中发挥重要功能的基因。本项目的开展对阐明高羊茅富集土壤重金属铅的分子机理具有重要意义，可为基因工程选育铅富集高羊茅新品系提供基因资源，并促进铅污染土壤植物修复技术的发展。

高羊茅具有较强的铅富集能力，能够用于修复铅污染土壤，但其富集铅的分子机理尚不清楚。通过鉴定不同来源高羊茅铅富集特性，我们获得了1个铅富集能力强的基因型AST7001和1个不能富集铅的基因型Silverado。利用RNA-seq 技术，分析两种高羊茅的转录组差异；通过RACE 技术获得关键基因的全长cDNA ，并采用转基因技术进行功能验证，以期获得在高羊茅铅富集中发挥重要功能的基因。取得的研究成果如下：.1）对两种高羊茅进行铅处理不同时间，利用HiSeq2000进行转录组测序，共得到25415个Unigene，总长度为36859338bp，Unigene 平均长度为1450bp，最大长度为14472bp，N50为2048bp，Unigene的平均GC含量为48.29%。.2）对Unigene的基因功能进行分类，共有18591个Unigene被注释到NOG数据库的26个功能亚类中。其中，涉及信号转导机制（9.26%）以及与翻译后修饰、分子伴侣（7.53%）相关的基因富集度最高。表明高羊茅在受到铅胁迫后，体内感知和传递胁迫信号的大量基因发生表达变化，从而引起下游基因的转录和翻译发生改变，以适应胁迫环境。.3）铅胁迫处理能够诱导Silverado部分基因的表达，处理时间增加，受诱导的基因数目增多。对AST7001来说，在铅处理初期，较少基因发生变化，但随着处理的延长，大量的基因被铅诱导表达。两种高羊茅存在大量响应铅胁迫的差异表达基因，在KEGG数据库中显著富集在机体系统中的感觉系统和代谢通路中的萜类和聚酮类化合物代谢，可能是造成高羊茅铅富集特性不同的关键基因。.4）对差异基因表达量进行聚类分析，发现不同处理组样品间基因表达呈现很高的差异性。Real time PCR结果证实了转录组测序的可靠性。.5）利用RACE技术，克隆得到了10个基因的全长cDNA序列，并成功将3个基因（ANK, TPK, met）克隆到了超表达载体PBI121中，利用农杆菌介导法将这3个基因转移到了高羊茅“猎狗5号”，目前正在进行转基因株系的表型鉴定。.本研究首次分析了具有不同铅富集特性高羊茅的转录组差异，获得了大量差异表达的Unigene,对阐明高羊茅富集铅的分子机理具有重要意义，而克隆全长基因可作为候选基因资源进行铅富集高羊茅新品种选育，从而促进铅污染土壤的植物修复。